Kolagen je jednou z hlavních strukturních proteinových složek organismu. Tvoří významnou část všech tělesných proteinů, asi polovina je v kostech a až 40 % v kůži. Celková zásoba v těle činí 3 až 4 kg u dospělé osoby, z toho kolagenu typu I asi 2 - 3 kg.

Základní údaje (výskyt, vlastnosti, struktura)

Chemicky jde o glykoproteiny, kódované na více než 30 genech lokalizovaných na nejméně 9 chromosomech. Celkem bylo nalezeno 18 odlišných typů.

Kolagen typu I je přednostně v kosti, synovii a dentinu, kolagen typu II je ve chrupavce (vylučování je degradačních produktů proto stoupá u revmatoidní arthritidy, osteoarthritidy a závažných forem Pagetovy choroby), kolagen typu III je např. v synovii.

Hlavním typem je kolagen typu I, který tvoří asi 70 % veškerého kolagenu a byl nalezen zejména v kosti, dále v kůži, šlachách, ligamentech, skléře, rohovce a cévách. Kolagen typu I v kůži není strukturálně a funkčně totožný s kolagenem typu I v kostech. Strukturně tvořen třemi řetězci: alfa1/alfa1/alfa2. Řetězce jsou uspořádány do trojšroubovice, jejíž strukturu určuje opakující se sekvence (Gly-X-Y)n. Asi v jedné třetině těchto sekvencí je na pozici X prolin a na pozici Y hydroxyprolin. Molekulová hmotnost kolagenu je asi 300000, délka řetězce (zahrnující telopeptidy a helikální část) je asi 300 nm. Helikální části kolagenu jsou málo imunogenní, vysokou imunogenitu mají propeptidy a telopeptidy.

Syntéza

Genetická informace pro syntézu řetězců alfa(1) a alfa(2) kolagenu typu I je na chromozomech 17 a 7 a je rozdělena na řadů exonů. Vlastní syntéza řetězců pro-alfa probíhá na ribozomech a tyto řetězce se transportují do endoplazmatického retikula, kde dochází k řadě enzymatických modifikací pomocí hydroxyláz a transferáz (prolyl 4-hydroxyláza, prolyl 3-hydroxyláza, lysylhydroxyláza - při jejímž deficitu se rozvíjí Ehlersův-Danlosův syndrom, hydroxylysin galaktosyltransferáza, galaktosylhydroxylysin glukosyltransferáza). Kolagen typu I je v kosti syntetizován osteoblasty jako prokolagen, který má globulární N-terminální a C-terminální peptidické řetězce, tzv. propeptidy prokolagenu (PICP, propeptid prokolagenu typu I, C-terminální a PINP, propeptid prokolagenu typu I, N-terminální).

Propeptidy

Součástí prokolagenu jsou C-terminální (PICP) a N-terminální (PINP) propeptidy. Funkcí propeptidů je zajistit uspořádání tří řetězců typu alfa a zabránit předčasné agregaci do fibril uvnitř osteoblastů. U dospělých se vyskytují v poměru kolem 1:1, což odpovídá ekvimolárnímu poměru jejich odštěpení. Štěpení zajišťují proteolytické enzymy - prokolagen N-proteináza a prokolagen C-proteináza. Existuje řada problémů s jejich stanovením, výpovědní hodnota obou typů navíc není totožná. Rozdílné chování je dáno odlišným metabolismem a eliminací. V dětském věku převládá v plazmě PINP, totožné koncentrace s PICP dosahuje na konci puberty. Deficit thyreoidnálních hormonů se může projevit poklesem PINP a vzestupem PICP. Terapii malými dávkami estrogenů lépe odráží PINP, z neznámých důvodů se koncentrace PINP u Pagetovy choroby zvyšuje 6x více než koncentrace PICP (Risteli, 1997).

Příčné vazby (crosslinks)

Z posttranslačních modifikací kolagenu je po hydroxylaci (lysinu a prolinu, kvantitativně odlišně vyjádřené u různých typů kolagenu) nejvýznamnější tvorba příčných vazeb (crosslinks). Typická je hlavně pro kolagen typu I a II. Kolagenní fibrily se uvnitř trojšroubovice i mezi sebou propojují intermolekulárními spojkami - příčnými vazbami (crosslinks). Tím se dokončuje proces vyzrávání kolagenních fibril, vzájemně propojených do sítě zřetelné již mikroskopicky. Porucha propojování je typická například pro osteogenesis imperfecta.

Předpokladem pro tvorbu příčných vazeb je oxidativní deaminace lysinu a hydroxylysinu, která je posledním krokem enzymatické tvorby kolagenu. Jedná se o oxidaci epsilon-aminoskupiny lysinu a hydroxylysinu za vzniku odpovídajícího aldehydu.

Aminokyselina Oxidativní deaminace Aldehyd

lysin lysyloxidáza (E.C. 1.4.3.13) allysin

hydroxylysin hydroxyallysin

Dva takto vytvořené aldehydy spontánně vzájemně reagují nebo se aldehyd váže na epsilon-aminoskupinu za vzniku bivalentních příčných vazeb spojujících dva polypeptidové řetězce. Následuje proces vyzrávání příčných vazeb, kdy se z bivalentních struktur stávají trivalentní příčné vazby spojující tři polypeptidové řetězce. Příčné vazby jsou typické pro zralé kolagenové molekuly a nevyskytují se v prokolagenu. Nesouvisejí tedy s osteoformačními procesy, ale pouze s osteorezorpcí.

Jako pyridinolin (hydroxylysylpyridinolin) se označuje cyklická struktura za tří hydroxylysinových residuí, zatímco deoxypyridinolin (lysylpyridinolin) je cyklická struktura pocházející ze dvou hydroxylysinových a jednoho lysinového zbytku (Robins, 1996). Vyskytují se hlavně v nehelikální C-terminální a N-terminální oblasti molekuly kolagenu, nazávané telopeptid. Z telopeptidu se příčná vazba propojuje s helikální oblastí další kolagenové molekuly.

Vlastní zralé příčné vazby jsou trivalentní, neredukovatelné a fluoreskující struktury. Pro mechanismus jejich syntézy je několik teorií. Obsah pyridinolinů v kostním kolagenu je kolem 0,2 mol/mol kolagenu, teoretický poměr však dosahuje maximálně 2 mol/mol kolagenu. Vysoký obsah pyridiniových příčných vazeb je v telopeptidu kolagenu typu III, což komplikuje specifitu stanovení s ohledem na kostní metabolismus.

Molekulová hmotnost je asi 400 (molekulová hmotnost pyridinolinu 429,37 a deoxypyridinolinu 413,34 Da), mají 3 aminoskupiny a 3 karboxylové skupiny. Vázané formy mohou být glykosylované (vazba galaktózy a glukózy přes kyslík hydroxylové skupiny deoxypyridinolinu), případně navázané na malé peptidy.

Část příčných vazeb (tzv. nezralé cross-links) jsou divalentní struktury a tvoří 20 – 25 % celkových příčných vazeb. Nezralé příčné vazby jsou zejména v místech kalciových depozit a mineralizace vyzrávání příčných vazeb inhibuje. Kromě pyridiových příčných vazeb jsou i příčné vazby s pyrrolovým jádrem, konkrétně se jedný o lysylpyrrol a hydroxylysylpyrrol. Většina pyrrolových příčných vazeb je v aminoterminální telopeptidové oblasti (asi 85 %). Peptidy obsahující pyrrolové příčné vazby mají v moči tendenci k agregaci (Risteli, 1997). Dalším typem příčné vazby je pentosidin. Pentosidin se vyskytuje mnohem častěji ve tkáních starších jedinců (Takahashi, 1995).

Deoxypyridinolin se vyskytuje zejména v kosti a dentinu, výskyt pyridinolinu zahrnuje i jiné tkáně. Poměr PYR:DPYR je v kortikální (4,38:1) a trabekulární (4,33:1) kosti podobný jako v aortě (4,29:1), ale zásadně odlišný od šlach (14,7:1), ligament (9,4:1) a mírně odlišný od dentinu (3,54:1).

Poměr PYR:DPYR může mít diagnostický význam. U Ehlersova-Danlosova syndromu (typ VI) tento poměr klesá na hodnotu 1:4, protože podkladem choroby je deficit lysylhydroxylázy s následnou přednostní tvorbou DPYR.

Povrzený výskyt crosslinks ve svalové tkáni obratlovců, závislý na stáří, funkci a trénovanosti svalu, se velmi pravděpodobně netýká lidského species.

Degradace kolagenu

Enzymatická degradace kolagenu je zprostředkována řadou enzymů. Pyridiniové příčné vazby se v plazmě a moči vyskytují ve formě

volné,
vázané na nízkomolekulární peptidy a glykosylované formy.

Volných forem PYR a DPYR v moči je kolem 40 % až 50 % z celkové koncentrace, ale rozptyl hodnot je značný. Pomocí kapalinové chromatografie se stanovují volné nebo celkové koncentrace PYR a DPYR (po hydrolýze na volné formy), pomocí imunoanalytických metod se stanovují buď volné molekuly PYR a DPYR nebo (telo)peptidy tyto příčné vazby obsahující. Vylučování příčných vazeb je závislé na věku (v dětství asi 10x vyšší koncentrace než v dospělosti). Pohlaví vliv nemá s výjimkou menopauzy, kdy se v porovnání s muži vylučování u žen zvyšuje. Fyziologicky se vyskytují cirkadiánní rytmy s maximem vylučování v pozdní noci a minimem s pozdním odpoledni. Amplituda během dne tvoří 10 až 100 %, mezidenní rozptyl u celkových i volných forem do 63 % podle uspořádání studie. Patologické změny vylučování jsou ve smyslu zvýšení při kostní remodelaci, po frakturách a po výraznější fyzické zátěži, snížení vylučování u renálních poruch, při malnutrici a při úspěšné léčbě patologicky zvýšené remodelace kalcitoninem, estrogenními hormony a bisfosfonáty. Důležité je zjištění, že frakční exkrece volné formy PYR a volné formy DPYR je větší než 1,0 (2,34 +/- 0,20 a 2,08 +/- 0,23), kdežto na peptidy vázané (konjugované) formy mají frakční exkrece pod 1,0 (0,56 +/- 0,07, resp. 0,55 +/- 0,06). To svěčí pro renální původ volných forem PYR a DPYR (Colwell, 1996). Volné formy mají také významně (přibližně 4x) vyšší clearanci než formy konjugované (Colwell, 1996). Zatím panuje značná nejistota o vypovídací schopnosti jednotlivých forem příčných vazeb. Změny ve vylučování volných forem PYR a DPYR jsou méně výrazné než změny vylučování celkových PYR a DPYR v pubertě, při terapii bisfosfonáty, při HRT, při suplementaci kalciem a vitaminem D. V jiných situacích naopak mohou selhávat celkové příčné vazby a lepší vypovídací schopnost mají telopeptidy s příčnými vazbami, zejména stanovované v moči (NTx).

Literatura

· Colwell, A., Eastell, R.: The renal clearance of free and conjugated pyridinium cross-links of collagen. J. Bone Miner. Res., 11, 1996, č. 12, s. 1976 - 1980.

· James, I.T., Walne, A.J., Perret, D.: The measurement of pyridinium crosslinks: a methodological overview. Ann. Clin. Biochem., 33, 1996, s. 397 - 420.

· Risteli, J., Risteli, L.: Assays of type I procollagen domains and collagen fragments: Problems to be solved and future trends. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 57 (Suppl. 227), 1997, s. 105 - 113.

· Robins, S.P., Duncan, A., Wilson, N., Evans, B.J.: Standardization of pyridinium crosslinks, pyridinoline and deoxypyridinoline, for use as biochemical markers of collagen degradation. Clin. Chem., 42, 1996, č. 10, s. 1621 - 1626.

· Takahashi, M., Hoshino, H., Kushida, K., Inoue, T.: Direct measurement of crosslinks, pyridinoline, deoxypyridinoline, and pentosidine, in the hydrolysate of tissues using high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem., 232, 1995, č. 2, s. 158 - 162.

Další informace

· Kolagen I

· Kolagen III

· Deoxypyridinolin celkový v moči

· Pyridinolin celkový

· Propeptid prokolagenu I C-terminální v plazmě

· Propeptid prokolagenu I C-terminální

· Propeptid prokolagenu I N-terminální

· Hydroxyprolin - odpad močí

· Proteiny buněčné a strukturální

Antonín Jabor

Kolagen: základní vlastnosti