Obecná charakteristika nádorových markerů

 

 

Úvod

Zhoubné novotvary zaujímají mezi ostatními nemocemi mimořádné postavení nejenom pro jejich stále rostoucí incidenci, ale i pro náročnou zdravotnickou péči. V první polovině devadesátých let vzrostla v České republice statisticky významně incidence nádorů ledvin, kolorekta, melanomu, žlučníku a žlučových cest, štítné žlázy a močového měchýře; pouze u mužů navíc incidence prostaty, jater, varlete a mnohočetného myelomu, jen u žen také hrtanu, průdušnice a plic, prsu, vaječníku a hodgkinských lymfomů. U obou pohlaví signifikantně poklesla incidence nádorů žaludku. 

 

Sérové nádorové markery představují důležité parametry, které mohou usnadnit predikci vývoje onemocnění u onkologických nemocných. Racionální využití nádorových markerů předpokládá znalost správné indikace vyšetření, jejich diagnostické hodnoty, klinické senzitivity a specificity, analytických možností, faktorů ovlivňujících vyšetření a interpretace výsledků. Možnosti klinického využití pro screening, primární diagnostiku, prognózu, predikci návratu choroby, monitorování terapie i algoritmus pro hledání lokalizace neznámého primárního tumoru jsou uvedeny ve vztahu k nejčastějším maligním tumorům a jednotlivým nádorovým markerům.

 

Pokrok v oblasti diagnosticky maligních nádorů, stejně jako nové poznatky o terapii těchto závažných onemocnění, byl umožněn v posledním desetiletí rovněž rozvojem v oblasti nádorových markerů. I když screening pomocí nádorových markerů je využíván pouze u rizikových skupin a v oblasti primární diagnostiky má též pouze omezený význam, vyšetřování sérových markerů při sledování nemocných ve vztahu k časnému záchytu recidivy choroby i efektu nádorové terapie se stává nezbytnou součástí onkologických léčebných postupů.

 

 

Definice nádorových markerů

Nádorové markery jsou definovány jako molekuly převážně proteinového charakteru, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jejich výskyt ve tkáni zhoubného nádoru (celulární nádorové markery) a v tělních tekutinách (humorální nádorové markery, viz tab. 1) souvisí s růstem nádoru v organismu; jsou produkovány buď samotným nádorem (s nádorem asociované antigeny), nebo jinými tkáněmi jako odpověď na maligní proces v organismu (indukované nádorové markery, např. proteiny akutní fáze). Snaze nalézt a vyšetřovat faktory, které by umožnily odhadnout prognózu vývoje onemocnění a predikovat odpověď na terapii onkologických nemocných, je v poslední době věnována (vedle studia genetických faktorů) velká pozornost.

 

Vyšetřování tkáňových biologických markerů souvisejících s hormonální závislostí nádorů (steroidní receptory), s jejich metastatickým potenciálem (proteinázy), s růstem ( růstové faktory a jejich receptory), s proliferací, apoptózou, angiogenezí, imortalitou, genomovou instabilitou (onkogeny, supresorové geny a jejich produkty) a chemorezistencí je však většinou v začátcích, kromě již klasické rutinně užívané metody stanovení steroidních receptorů. Podkladem pro tuto novou oblast prediktivní onkologie jsou jednak studie nových parametrů založené na metodikách imuno(histo)chemie, enzymologie, především však molekulární biologie.

 

Přítomnost nádorových markerů v tělních tekutinách je podmíněna přechodem těchto látek z místa syn­tézy (nádorová tkáň) do cirkulace. Koncentrace nádorových markerů v séru má obvykle přímý vztah k typu a rozsahu one­mocnění. Vzhledem k širokému spektru nádorových onemocnění neexis­tuje dosud univerzální nádorový marker a ani senzitivita (správný záchyt nemocných) při dostatečné specificitě (správná negativita u lidí bez nádorového onemocnění) nedosahuje ideálních 100 %. Proto tedy nezvýšená koncentrace nádorového markeru není ještě důkazem nepřítomnosti maligního onemocnění, a naopak pozitivní výsledek nemusí nutně znamenat zhoubný nádor. Ideální by byly takové markery, které by byly orgánově specifické, detekovatelné v co nejčasnějším stadiu maligní transformace, které by korelovaly s růstem nádoru, stadiem, prognózou a účinností terapie. Diagnostický práh nádorových markerů, samozřejmě nesrovnatelný s metodikami molekulární biologie s využitím PCR, umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 10⁶ maligních buněk, zatímco kli­nická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru, který obsahuje asi 10⁹ buněk.

 

Určitou skupinu nádorových markerů tvoří onkofetální an­tigeny, tj. látky, které mají důležité funkce během vývoje plodu. Produkce těchto látek se ve zdravých tkáních po narození snižuje až zastavuje, přesto však lze nízké kon­centrace i u zdravých osob zachytit. Při maligním procesu dochází prostřednictvím aktivace určitých genů k obnovení jejich produkce. Některé nádorové markery mají vztah k procesu proliferace, event. k procesům asociovaným s růstem nádoru, které mohou reflektovat rovnováhu mezi proliferací, apoptózou, případně degradací ve tkáni primárního nádoru. K nádorovým markerům počítáme rovněž někte­ré enzymy, hormony nebo jiné tkáňové metabolity. Tyto látky (především hormony) mohou vykazovat ektopickou produkci, tj. syntézu ve tkáni, v níž za fyziologického stavu nejsou produkovány (tab.1).

 

Diskriminační hranice pro hodnocení zvýšené hladiny nádorových markerů v séru při diagnostice primárního nádo­rového onemocnění je definována jako koncentrace, pod níž leží většina sérových hodnot zdravých lidí i nemocných s onemocněním benigním. Pro sekundární diagnostiku (při hodnoce­ní možného návratu choroby ve formě lokální progrese či diseminace) je však tře­ba použít jako vztažnou skupinu nemocné v kompletní remisi. Senzitivita (i cut–off) pak může být pro obě fáze onemocnění odlišná.

 

Ideální marker by měl mít 100 % specificitu při co nejvyšší senzitivitě. Vzhledem k tomu, že žádný z dosud známých nádorových markerů této specificity nedosahuje, nastavuje se obvykle diskriminační hranice tak, aby zaručovala 95 % specificitu; pro ni se pak uvádí senzitivita. Často je však senzitivita udávána při použití komerčně doporučené diskriminační hladiny (cut-off); v tomto případě není vždy zaručena alespoň 90 % specificita. Vztah senzitivity a specificity vyjadřuje ROC křivka (Receiver Operating Characteristics, obr.1). Velké zakřivení křivky (co největší plocha pod křivkou, průběh co nejblíže levé a horní ose) je známkou vhodnosti nádorového markeru pro danou skupinu onemocnění. Charakteristiky testu, vyjádřené pomocí senzitivity a specificity, jsou doplněny hodnocením pravděpodobnosti, že při pozitivním testu je vyšetřovaná osoba skutečně nemocná (pozitivní predikční hodnota), ev. že při negativním výsled­ku je skutečně zdravá (negativní predikční hodnota).

 

 

 

Aplikace tumormarkerů v klinické praxi

 

Screening: vzhledem k poměrně nízké diagnostické senzi­tivitě a specificitě není většina nádorových markerů vhodná k tomuto účelu u asymptomatických vyšetřovaných. Je to zřejmé z příkladu CEA, kde předpokládáme, že má pro karcinom tlustého střeva vysokou 70 % senzitivitu při 95 % specificitě. To znamená, že marker na jedné straně nezachytí 30 % nemocných (třeba i s pokročilým onemocněním) a na straně druhé naopak 5 % vyšetřovaných nesprávně označí jako pozitivní. Při vyšetřování v rámci screeningu by to představovalo velké množství nesprávných výsledků. Jiná je však situace u symptomatických nemocných nebo u skupin s vysokým rizikem. Jako příklad lze uvést vyšetřování AFP u nemocných s jaterní cirhózou vzhledem k možnosti vzniku hepatocelulárního karcinomu, vyšetřování TPA (TPS) vzhledem k možnému výskytu ca močového měchýře u profesně rizikových skupin, nebo vyšetřo­vání kalcitoninu v rodinách s familiárním výskytem medulár­ního karcinomu štítné žlázy, AFP a hCG u rizika výskytu ná­dorů z germinativních buněk i sledování paraproteinů vzhle­dem k možnému vzniku mnohočetného myelomu. Také u mužů nad 50 let je některými autory doporučován screening PSA vzhle­dem ke karcinomu prostaty.

 

Primární diagnostika: podobně jako pro screening nebýva­jí nádorové markery často vhodné ani pro primární diagnosti­ku, a to ze stejných důvodů; navíc i proto, že jejich orgá­nová specificita je většinou malá. Mohou však být nápomocné při hledání primárního nádoru u prokázaných metastáz, nebo v diferenciální diagnostice u pacientů se suspektním zhoub­ným onemocněním, nejlépe s použitím počítačového programu, který k zadaným výsledkům nádorových markerů a s přihlédnu­tím k věku a pohlaví pacienta nabídne na základě epidemiolo­gických údajů nejpravděpodobnější diagnózy.

 

Staging: zde může vysoká hodnota nádorového markeru upozornit na špatně určené nižší stadium choroby. Prognóza nepředstavuje podstatnou roli sérových nádorových markerů. Určitý význam má CEA u kolorektálních karcino­mů, AFP a hCG u germinativních tumorů, nebo B2M u mnohočet­ného myelomu.

 

Sledování průběhu choroby je hlavní doménou indikace těchto vyšetření. Analýza hladin nádorových markerů v krvi bývá přínosná pro hodnocení remise, resp. podezření na rezi­duální nádor. Vzestup hladin nádorových markerů představuje včasné upozornění (předcházející klinickou diagnózu nezřídka o více než 6 měsíců) na návrat choroby ("lead time"). Je vhodné sledovat kinetiku nádorových markerů a hodnotit vý­razné změny i ještě v rámci referenčního rozsahu.

 

Sledování efektu terapie pomocí nádorových markerů je neocenitelným pomocníkem lékaře. Vzhledem k různým biologic­kým poločasům jednotlivých markerů (tab.2) je nutno správně volit intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně po­stihl efekt terapie a ne "lysis fenomen", tj. krátkodobý prudký nárůst hladiny markeru jako odpověď na terapii . Proto vyšetřujeme nádorové markery pro posouzení úspěšnosti terapie nejdříve koncem třetího týdne, lépe ve 4.týdnu od aplikace terapie. Tato oblast se v poslední době dostává do centra zájmu onkologů.

 

 

Vlastní používání tumormarkerů

 

Pro frekvenci vyšetřování platí kritéria doporučená WHO a podle zkušeností kliniků i statistiků hodnotících dynamiku změn nádorových markerů ve vztahu ke klinickému průběhu choroby je třeba dodržovat doporučenou frekvenci vyšetření. Nejčastěji jsou navrhovány tyto intervaly: 1 měsíc v prvním roce po primární terapii, 2 měsíce ve druhém roce, 3 měsíce v dalších letech sledování. Koncentrace nádorového markeru má být dále vyšetřena: před nasazením terapie, po skončení terapie (podle poločasu markeru, obvykle 3.–4. týden), při změně terapie, dále i při nejasném průběhu nemoci.

 

K laboratornímu vyšetření koncentrace nádorových markerů jsou obvykle používány metody imunochemické analýzy. Principem těchto reakcí je vazba mezi antigenem (nádorovým markerem) a k němu specifickou protilátkou. Detekci vytvořeného imunochemického komplexu umožňuje značení radionuklidem (radioimunoanalýza, RIA, nebo imunoradiometrické stanovení, IRMA), enzymem (enzymoimunoanalýza, EIA, ELISA), fluorescenčním ev. chemilumi­niscenčním indikátorem (FIA, CLIA). Pro kvantifikaci nádoro­vých markerů mohou být použity i další metody - např.in vitro tvorba značeného produktu ze značeného substrátu (radioenzy­mostanovení thymidinkinázy). Koncentrace markerů v séru se pohybuje ve velice nízkých hodnotách (podle typu parametru řádově obvykle v mg/l). Poněvadž standardní materiál může být v různých komerčních soupravách rozdílný podle stupně purifikace (neexistují obvykle WHO standardy), je pak koncentrace vyjadřována v konvenčních jednotkách (U/l, kU/l atd.).

 

Výběr optimální metody stanovení je ovlivněn především parametry spolehli­vosti vlastního metodického postupu (přesnost, správnost, detekční limit, použitelné koncentrační rozmezí, specificita protilátek). Je však třeba vzít v úvahu také další faktory : možnost automatizace, nutné přístrojové vybavení, stabilitu reagencií, možnost co nejjednodušší a nejstabilnější kalibrace (při opakované kalibraci téže šarže možnost použít rekalibraci pouze pro jednu vybranou koncentraci z kalibrační křivky), dále čas nutný k vyšetření a v nepos­lední řadě i cenu vyšetření. Při zavádění analýzy určitého nádorového markeru je třeba rovněž zvážit očekávané počty požadovaných stanovení, v případě malých sérií je výhodnější soustřeďovat vyšetření na vybraných pracovištích. Na jed­nom typu automatického analyzátoru lze používat obvykle diagnostické soupravy pouze od jednoho výrobce - to s sebou přináší nutnost vazby na jeho nabídku setů. Dlouhodobé sle­dování vyžaduje nestřídat soupravy od různých výrobců pro jeden marker. Vnitřní kontrola správnosti vyšetření je založena na sle­dování obvykle dvou hodnot, a to fyziologické a patologické hladiny parametru. Dalším prostředkem pro sledování spo­lehlivosti metody je stanovení mediánu hodnot souboru nemoc­ných za určité období. Dodržo­vání správné laboratorní práce při vyšetřování nádorových markerů je obzvláště důležité vzhledem ke značné finanční náročnosti vyšetření.

Pro správnou interpretaci změn v hladinách markerů, ze­jména při dlouhodobém sledování nemocných s nádorovými chorobami, je třeba vyloučit všechny faktory, které by mohly stanovení ovlivnit již v preanalytické fázi. Je potvrzeno, že v určitých přípa­dech mohou být výsledky stanovení ovlivněny některými vyšetřovacími zásahy (ale i jinými vlivy); např. pro stanovení PSA smí být odebrána krev nejdříve 48 hod po rektálním vyšetření prostaty. Kontaminace vzorku při odběru je faktor, který může znehodnotit např. stanovení SCC (kontaminace slinami, potem), NSE (hemolýzou - oddělení séra od krevních elementů je třeba provést nejpozději do 1 hod ). Významnou roli hraje stabilita vzorku. Není-li stanovení provedeno do maximální výrobcem doporučené doby uložení při +4^°C, je třeba vzorek zamrazit. Vlastní analytický postup vyžaduje vzhledem k dlouhodobé­mu sledování pacientů vysoký stupeň reprodukovatelnosti.

 

Při hodnocení vyšetření je třeba zvážit další faktory, které by mohly přispět k falešné pozitivitě výsledku. Jsou to především zvýšené hladiny nádorových markerů v důsledku jejich produkce u nemaligních onemocnění, nebo poruch jejich vylučování (při zhoršené funkci jater nebo ledvin). K falešně pozitivním výsledkům mohou přispět i tzv. heterofilní myší protilátky (HAMA), které se mohou v tělních tekutinách objevit především jako důsledek reakce organismu na myší bílkoviny, podané např. za účelem diagnosti­ky nebo terapie. Pro většinu nádorových markerů je z literatury znám biologický polo­čas v séru, který je velmi rozdílný (tab.2); proto je třeba jej při hodnocení změn časového průběhu hladin zvažovat.

 

Jako signifikantní jsou posuzovány tyto změny hladin nádorových markerů:

a)       bez terapie (v klinické remisi): výrazný nárůst koncentrace ve 3 následných odbě­rech (i v rámci referenčních hodnot) značí recidivu, resp. progresi,

b)       během terapie: nárůst o více než 25 % značí progresi onemocnění, pokles o více než 50 % parciální remisi (kompletní remisi nelze pomocí změn v hladinách markerů hodnotit).

 

Matematicko-statistické postupy jsou využívány u nemocných sledovaných v zájmu časného zachycení případného návratu choroby ( např. program "CRACTES" ,tj. Cancer Recurrence, Analysis, Testing and Statis­tics). Tento program je schopný na základě výsledků 3 před­cházejících měření nádorových markerů v doporučených intervalech (ne delších než 3 měsíce) predikovat další vývoj hodnot těchto parametrů pro sledovaného nemocného a stanovit u něho pravděpodobnost návratu choroby na dalších 4-6 měsíců. Podobným způsobem, na základě vyhodnocení strmosti pokle­su hladin sérových markerů, může lékař velmi rychle získat informaci o účinnosti podávané terapie, případně o vhodnosti její změny. Program "BIANTA" (Bayesian Intelligent Associative Network for Tumor Analysis) pomáhá hledat primární nádor při průkazu metastáz neznámého původu na základě vyšetření nádorových markerů, věku a pohlaví nemocného a epidemiologických onko­logických údajů. Na podkladě známého klinického stavu u každého odběru je možno hodnotit rovněž senzitivitu a specificitu vyšetření, event. modifikovat optimální diskriminační hranici pro danou nádorovou lokalizaci. Matematické přístupy jsou také používány v hodnocení prog­nostických faktorů získaných peroperačně ze tkání (cytosolo­vé prognostické parametry), např. při statistickém hodnocení křivek přežití (či bezpříznakového přežití) sledo­vaných nemocných v závislosti na těchto parametrech. Všechny tyto moderní způsoby vyhodnocování předpokládají úzkou spolupráci laboratorních pracovníků s klinickými léka­ři, a to nejen formou konsultací laboratorních nálezů, ale i ve smyslu poskytování informací o klinickém stavu vyšetřovaných nemocných.

 

Obr.1.  ROC křivka  pro CEA a CA 15-3 pacientek s diagnózou  ca mammae

 

CEA

CA15-3

 

 

Tabulka 1. Rozdělení  nádorových  markerů

 

 

 

Tabulka 2. Biologický poločas nádorových markerů v séru