Preanalytická fáze: vliv antikoagulancií

Antikoagulancia se mohou uplatnit v preanalytické fázi různými mechanismy

 

Přesuny vody mezi ICT krevních buněk a ECT, resp. plazmou z osmotických důvodů

Výhodné antikoagulans je z tohoto důvodu heparinát lithný nebo směs draselných a amnonných solí citrátu. Sodné nebo draselné soli citrátu nebo oxalátu způsobují ztrátu ICT erytrocytů a diluci plazmy - koncentrace albuminu tak může klesat o 17 – 19 % proti hodnotám v séru. Čisté amoniové soli naopak vedou k přesunu plazmatické vody do buněk.

 

Diluce plazmy tekutými antikoagulancii

V případech použití větších objemů (platí zejména pro látky s objemově nižší antikoagulační mohutností jako je citrát nebo oxalát) musí být samozřejmostí, aby diluční faktor byl vždy zahrnut do výpočtu konečné koncentrace. V každém případě je nutné počítat s tím, že se část analytiky (dodržení poměru antikoagulacia a krve) vysouvá mimo laboratoř. Vypracování kontrolních mechanismů pro tyto účely (měření objemu vzorku krve dodaného do laboratoře, zpráva odebírající osoby o podmínkách odběru apod.) je dalším prvkem řízení jakosti. Významnou roli může sehrát mrtvý objem stříkačky s koncovkou Luer, pokud se použije vypláchnutí stříkačky heparinem. Tvoří přibližně 0,2 ml a u zkumavky o objemu 2 ml jde o 10 % diluci, která může být podstatně vyšší, pokud se nepodaří naplnit stříkačku zcela. U acidobazických vyšetření je v tomto případě více ovlivněno pCO₂ než pH. Kvantitativně se diluční efekt projevuje při použití tekutého heparinu nad objemovou mez 5 % ze vzorku krve. Nedojde ke změně pH, ale vede k poklesu pCO2 nejméně o 0,27 kPa, poklesu HCO₃^- a base excess o 1,2 mmol/l a vzestupu pO₂ o 0,53 kPa.

 

Chelátová vazba iontů, iontová výměny a změny

Heparin

Při společném stanovení pH, krevních plynů a elektrolytů v moderních vícekanálových analyzátorech je klíčovým problémem použití antikoagulační látky. Heparin váže ionty (Na⁺, K⁺, Li, Ca⁺⁺, Mg²⁺) a efekt se projeví zejména při použití vyšších koncentrací heparinu, samozřejmě podle použitého typu heparinu. Doporučuje se proto používat tzv. vyvážený (balancovaný) heparin, použití heparinátu sodného nebo lithného má svá úskalí. Heparin sodný nad 15 IU/ml krve zvyšuje koncentraci Na⁺, nad 50 IU/ml krve snižuje pH, HCO3^- a base excess, přičemž každých 100 IU/ml krve sníží pH až o 0,004, HCO3^- až o 0,3 mmol/l, base excess až o 0,3 mmol/l. Nad 15 IU/ml krve je nutné používat balancovaný heparin pro měření kalcia. Každých 100 IU sodného nebo lithného heparinátu na 1 ml krve způsobuje pokles kalcia asi o 0,13 mmol/l, snížení asi o 0,01 mmol/l lze pozorovat již od 4 IU/ml krve. Doporučené koncentrace heparinu závisí na způsobu použití (sklo, plast, tekutý nebo sušený heparin). Pracovní skupina při IFCC doporučuje meze uvedené v tabulce:

 

Vhodné koncentrace heparinu pro vyšetření v plazmě (Burnett, 1994)

 

Odběrová souprava	Aplikace	Konečná koncentrace heparinu v krvi (IU/ml krve)
sklo	suchý heparin	40 – 60
sklo	roztok heparinu	8 – 12
plast	suchý heparin	12 – 50
plast	roztok heparinu	4 – 6

 

 

Z popisu vyplývá nutnost profesionálně připravených odběrových souprav, nevhodné poměry mohou významně snižovat kvalitu vyšetření. Podobně i iontové složení heparinové protisrážlivé přísady hraje významnou roli u vícekanálových analyzátorů stanovujících různé ionty. Vhodné iontové koncentrace balancovaného roztoku heparinu uvádí další tabulka.

 

Vhodné iontové koncentrace heparinu pro vyšetření v plazmě (Burnett, 1994).

 

 

Iont	Rozmezí koncentrací	Jednotka
Na+	120 – 150	mmol/l
K+	3,5 – 4,5	mmol/l
Ca+	1,2 – 1,4	mmol/l
Cl-	100 – 139	mmol/l

 

Roztok nesmí obsahovat jiné vazebné anionty (hydrogenuhličitanový, fosfátový, sulfátový) a doporučené pH heparinového roztoku je mezi 6,0 – 8,0.

EDTA

Etylendiaminotetraoctová kyselina se používá ve formě solí jako antikoagulans pro stanovení parametrů krevního obrazu. K dispozici je K₂, K₃ a NA₂EDTA. ICSH a NCCLS doporučují jako nejvhodnější K₂EDTA pro  její dobrou rozpustnost a stabilní výsledky. Při používání K₃EDTA při vyšších koncentracích a delším stání dochází k výraznějšímu svrašťování erytrocytů a snižování MCV oproti K₂EDTA; používá se většinou tekutá a tím dochází k naředění vzorku; obecně K₃EDTA dává o 1 - 2 % nižší hodnoty všech přímo měřených parametrů krevního obrazu. Na₂EDTA naopak lehce zvyšuje objem erytrocytů. Zvýšení koncentrace EDTA také snižuje hematokrit. Bez ohledu na použitý typ EDTA je nutné odběrovou nádobku s krví 8 - 10 x opatrně otočit k zajištění řádného promíchání vzorku. EDTA (ale i obecně všechny chelatotvorné látky) může zapříčinit pseudotrombocytopenii,  ojediněle i  pseudoneutropenii.

Ostatní antikoagulancia

Principiálně se použití antikoagulancií uplatňuje jak vazbou měřených iontů (Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg²⁺, Fe), tak změnou katalytické koncentrace enzymů, které daný iont potřebují jako kofaktor. Typickým příkladem je snížení katalytické koncentrace ALP vyvázáním kationtů Mg²⁺ při použití EDTA, citrátu a oxalátu. Pokud se pro stanovení iontů použijí metody pracující s vysokou teplotou (plamenová fotometrie, atomová absorpce), stanovení koncentrace je spolehlivé vzhledem k uvolnění iontu z vazby.

 

Přímá interference antikoagulancia s analytickým postupem

Heparin může ovlivňovat některé metody stanovení albuminu, CK, CK-MB a v přítomnosti Mg²⁺ způsobuje precipitaci lipoproteinů (LDL a VLDL) se změnou optických vlastností reakční směsi, citrát inhibuje AMS (závisí na použité metodě), oxalát inhibuje LD a ALP. Heparin znemožňuje vyšetření koagulace, negativně také ovlivňuje vyšetření krevního obrazu včetně rozpočtu leukocytů na analyzátoru, vyšetření krevních nátěrů (i kostní dřeně); v citrátové krvi lze stanovit počty trombocytů, ostatní parametry krevního obrazu jsou ale zkreslené. Pro většinu koagulačních stanovení se k zábraně srážení krve odebírá vzorek do 0,109 M cit-rátu sodného v poměru 1díl citrátu na 9 dílů krve. Vzhledem k závislosti výsledku testů na poměru Ca²⁺ iontů a Ca²⁺ chelatujících činidel, musí být koncentrace těchto činidel v plazmě konstantní. Jakákoli disproporce tohoto poměru vede k ovlivnění výsledků koagulačních testů. Při vysokém hematokritu (> 0,60) nebo nízkém hematokritu (< 0,25) je nutné přepočítat množství potřebného citrátu sodného pro koagulační vyšetření podle vzorce

 

A = (100 – Hct) / (595 – Hct  ) x B

 

kde A jsou ml 0,109 M citrátu sodného zajišťujícího chelataci B, což jsou ml plné krve (Hct je hematokrit v procentech).

 

Značení antikoagulancií může být významným problémem, protože rozhodně není jednotné:

 

 

Protisrážlivé činidlo	NCCLS/ISO/ECCLS	Sarstedt
EDTA	fialová	červená (K3-EDTA, K2-EDTA)
Oxalát draselný
Citrát sodný (1:5)	černá	fialová
Citrát sodný (1:10)	modrá	zelená
Fluorid + oxalát	šedá
Fluorid		žlutá
Oxalát draselný a amonný
Heparinát lithný	zelená	oranžová
Heparinát sodný	zelená
ACD	žlutá
Bez přísad (neutral, sterilní prostředí)	červená	bílá
Aktivátor srážení, bez protisrážlivých přísad		bílá
Separační gel		hnědá
Citrát-pufr		modrá

 

 

 

Další informace

Preanalytická fáze

 

Antonín Jabor

.