Zákalové metody

Sleduje se primární záření procházející nehomogenním prostředím. Roztok zakalený jemnou sraženinou zeslabuje jeho počáteční intenzitu o podíl, který se na částicích rozptyluje (Tyndallův rozptyl).

Podobně jako barevnost roztoku, může být i intenzita zákalu mírou obsahu stanovované látky, která tvoří sraženinu. Na tomto principu jsou založeny zákalové metody - turbidimetrie a nefelometrie.

 

Turbidimetrie

Turbidimetrie je optická metoda měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem, absorpcí a odrazem na částicích. K poklesu intenzity procházejícího světla dochází zejména v důsledku rozptylu.

Je výhodné mít možnost kvantifikovat sraženinu bez jejího oddělení od roztoku, když je žádoucí rychlé stanovení a není dostupná žádná jiná vhodná metoda.

Závislost intenzity prošlého záření na vlastnostech absorbujícího prostředí je exponenciální:

 

I_t = I₀ . exp (- tL)

 

kde I_t = intenzita prošlého záření, I₀ = intenzita světelného zdroje, t = turbiditní koeficient, L = světelná dráha kyvetou.

Turbiditu lze měřit na jakémkoliv fotometru nebo spektrofotometru. Fotometrická citlivost se zvyšuje se snižující se vlnovou délkou. Největší citlivosti turbidimetrických metod je dosahováno modrým světlem (435-480 nm) za předpokladu bezbarvé suspenze.

V ředěných opalescentních roztocích je přechod mezi turbidancí a absorbancí pozvolný. V měřicím rozsahu je vztah mezi absorbancí a koncentrací částic pro malé částice obvykle lineární, ale může se měnit změnou vlnové délky záření. V imunochemických reakcích je často nelineární závislost mezi absorbancí a koncentrací částic. Při stanovení je největší problém donutit měřenou složku ke srážení ve formě jemně rozptýlených částic o vhodné velikosti.

Všechny možné proměnné hodnoty je třeba pečlivě sledovat. Zejména se jedná o poměr přidaných činidel, způsob míchání, protřepání apod. Je třeba dbát, aby byl blank < 0,25 A. Různé tvary kyvet dávají různé hodnoty absorbance. Na to se musí pamatovat, srovnávají-li se výsledky měření na různých přístrojích.

Vliv interferujících látek je třeba snížit na minimum i za cenu snížení citlivosti reakce, např. při thymolové zákalové reakci se používá červené světlo (nad 610 nm), aby se co nejvíce snížily interference bilirubinu a hemoglobinu přítomných ve vzorku séra. Jakýkoliv vliv, který způsobí vznik částic odlišné velikosti bude měnit hodnoty absorbance. Nejobtížnější je příprava reprodukovatelných a dostatečně stálých suspenzí. Je vhodné používat ochranné koloidy (polyetylenglykol).

Při silně zakalených roztocích je výhodnější měření zeslabení paprsku ve směru postupujícího záření (úhel 0°). Také hemolýza a ikterus ruší při turbidimetrii méně než při nefelometrii.

Na druhé straně by se turbidimetrické metody neměly používat tam, kde je zapotřebí velká přesnost a správnost stanovení (reprodukovatelnost turbidimetie je ~ 5%).

Hlavní použití turbidimetrie je v imunochemii. Také v klasické klinické biochemii je několik metod založených na měření stupně zákalu: test s kyselinou sulfosalicylovou (Extonovo činidlo) pro stanovení bílkovin v moči a moku, stanovení fibrinogenu, historická thymolová zákalová reakce (princip je tvorba komplexu γ-globulinů a β-lipoproteinů s thymolem) a další.

Schéma turbidimetrie (A) a nefelometrie (B)

 

 

 

Nefelometrie

Nefelometrie je optická metoda založená na měření intenzity bočně rozptýleného světla, obvykle v úhlu 90° i když laserové nefelometry používají mnohem menší úhel. Měří se záření rozptýlené na částicích (obvykle komplexů antigen-protilátka), tedy intenzita difúzního rozptylu. Intenzitu rozptýleného světla vyjadřuje Rayleighův vztah:

I_r = I0.K.N.ν²/λ⁴

kde I_r = intenzita rozptýleného záření, I₀ = intenzita světelného zdroje, K = konstanta závislá na indexech lomu částic, N = počet částic, ν = objem částic, λ = vlnová délka záření.

Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry (tzv. Tyndallovo světlo) a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření. Vlnová délka difúzně rozptýleného záření a záření zdroje je stejná, i když v malém rozsahu dochází na částicích k emisi záření o delší vlnové délce díky tepelným ztrátám. Optimální poměr mezi vlnovou délkou záření monochromatického zdroje a polo­měrem částic je 10:1, kdy dochází ke kulovému rozptylu (IgG 20 nm). U velkých agregátů Ag-Ab 400 – 1400 nm je rozptyl eliptický.

Konvenční nefelometry používají jako světelných zdrojů žárovku s halogenovou atmosférou nebo xenonovou výbojku. Optika těchto přístrojů obsahuje navíc interferenční filtr, neboť světelný zdroj po­skytuje polychromatické světlo. Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90°, protože stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký.

 

 

Laserový nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj mono­chromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Laserový paprsek pro­chází přes kyvetu s měřeným roztokem a rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úh­lem 5 až 35° (fotonkou nebo fotonásobičem). Pro nefelometrické měření jsou používány buď speciální přístroje – nefelometry nebo nefelometrický nástavec k fotometru (Tyndallovo světlo se sleduje pod úhlem 90°). Pro přibližně stejné přístrojové vybavení obecně platí, že nefelometrie je asi o jeden řád citlivější než turbidimetrie.

Nefelometrické měření se provádí nejčastěji ve dvou modifikacích, “end-point" nebo kinetické. Postup “end-point” je měření po uplynutí určitého časového intervalu. Nejčastěji jde o dobu 30-60 min, ale je známo, že již po 10 min je přítomno dost částic pro reprodukovatelné měření. Spolehlivost stanovení je značně závislá na způsobu uchovávání reakčního produktu. Citlivost stanovení je 0,1 mg/l.

Kinetické měření využívá vyhodnocení rychlosti nárůstu zákalu v čase. Doba měření je 1 min. Mez stanovitelnosti je přibližně 1 mg/l, ale vhodným přístrojovým uspořádáním za využití výpočetní techniky je možno mez stanovitelnosti snížit o jeden až dva řády. Nefelometrické metody ve vodném prostředí jsou používány především pro imunochemické reakce a vyznačují se vysokou přesností a dobrou reprodukovatelností. Nefelometrie je o řád citlivější než turbidimetrie. Závislost odezvy nefelometru na koncentraci stanovované bílkoviny je obecně nelineární. Jde většinou o polynom druhého či třetího řádu. Obecně platí, že linearita měření je tím lepší, čím je koloidní disperze více naředěna nebo je menší velikost částic.

Na zákalové měření koloidů mají vliv vlastní zákaly sér. Silně lipemická séra je nutno ze zpracování vyřadit. Důvodem je obtížnost měření malého přírůstku absorbance částic na relativně vyso­kém pozadí zákalu. Při nefelometrickém měření se vzorky ředí ve vyš­ším poměru než u turbidimetrie a blank by neměl přesáhnout 25 % měřené hodnoty zákalu. Barevné produkty hemolýzy a žlučové pigmenty (hemolytická a ikterická séra) interferují více při nefelometrii než při turbidimetrii.

Problém nefelometrické analýzy je, že různými přístroji kalibrovanými tímtéž standardem se pro stejný vzorek naměří rozdílné hodnoty. Spolehlivost stanovení závisí na uchovávání reakčního produktu během měření, osvětlení, teplotě, druhu materiálu reakční kyvety a tvaru reakční kyvety.

Nefelometrie se používá se ke studiu relativních změn koncentrace v disperzních soustavách, nejen v biochemii, ale i při sledování růstu mikrobiálních buněk. Vyžaduje speciální přístrojové vybavení a má omezené použití.

 

 

Petr Štern

.