Zjišťování primární struktury (poly)peptidů
se nazývá rovněž sekvenování. Před zjišťováním primární struktury (poly)peptidu
je nutno nejprve stanovit zastoupení aminokyselin. Peptidy musí být předem
vyčištěny pomocí purifikačních technik. Aminokyselinové složení lze stanovit
po kyselé hydrolýze, vyžaduje však korekce na ztráty některých
aminokyselin. Uvolněné aminokyseliny jsou separovány a identifikovány pomocí
HPLC nebo ionexovou chromatografií.
Schéma určování sekvence aminokyselin:
Ke stanovení primární struktury se používá
automatizovaná Edmanova technika (automatický sekvenátor).
Edmanovo odbourávání je založeno na postupném odstraňování a identifikaci
N-koncových aminokyselin jako fenylthiohydantoinových derivátů. Disulfidové
vazby musí být nejprve oxidovány nebo redukovány, velké peptidy rozštěpeny na
menší fragmenty v místech řídce se vyskytujících aminokyselin (specifické
štěpení polypeptidového řetězce, např. účinkem CNBr). Směs fragmentů je nutno
před sekvenováním rozdělit na jednotlivé peptidy. Odbourávání N-koncových
aminokyselin je usnadněno navázáním C-konce peptidu na pevný nosič.
V průběhu jedné operace je možno určit pořadí asi čtyřiceti po sobě
následujících aminokyselinových zbytků. K jejich identifikaci se používá
HPLC.
Aby bylo možno určit pořadí fragmentů
v původním polypeptidu, provádí se sekvenování překrývajících se fragmentů
uvolněných jinými postupy štěpení. Doplňující informace poskytuje metoda
sekvenování DNA příslušného genu.
Jaroslava Vávrová, Vladimíra Kvasnicová
.