Stanovení kyselé
fosfatázy
Synonyma
fosfát-monoester fosfohydrolasa, EC 3.1.3.2;
kyselá fosfatasa; kyselá monofosfatasa; glycerofosfatasa;
fosfomonoesterasa; kyselá fosfomonoesterasa;
kyselá fosfohydrolasa; kyselá fosfomonoesterhydrolasa; ortofosforečný
monoester fosfohydrolasa;
kyselá nukleosiddifosfátfosfatasa; uteroferin.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní
pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza.
Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení
AP (Google 413 000), případně ACP (Google 46 300). Upozorňujeme, že
označení AP se používá jak pro alkalickou, tak pro kyselou fosfatázu.
Preanalytická fáze
Vzhledem k dennímu rytmu je třeba odebírat ráno. Odběr
neprovádět po digitálním vyšetření prostaty nebo po její masáži. Nešetrné
zacházení se vzorkem vede k uvolnění ACP z trombocytů. Transport
provádět v ledové tříšti. Při vyšetření se dává přednost plazmě
(doporučuje se EDTA, protože heparin výsledky snižuje) před sérem (aktivita ACP
v séru je vyšší). Stabilitu vzorku lze zvýšit úpravou na pH 6
(hydrogensíran sodný + ředěná kyselina octová). Může se také stanovovat
seminální ACP, případně v moči.
Stabilita vzorku po úpravě na pH 6: 20 - 25 °C: 8 dní, 4 - 8 °C: 8
dní, -20 °C: 4 měsíce; bez úpravy pH: 20 - 25 °C: 2 h, 4 - 8 °C: 8 h, -20 °C: 1
den.
Koncentrace ACP v erytrocytech je vyšší než v séru a
hemolýza proto výsledky měření falešně zvyšuje. Zbytky saponátů, fosfátů a
těžké kovy inhibují ACP.
Popis metody
Kyselá fosfatáza EC 3.1.3.2. je označení pro skupinu nespecifických
fosfatáz, které katalyzují přesun fosfátové skupiny z jednoho hydroxylu na
druhý hydroxyl:
resp. hydrolýzu organických esterů kyseliny fosforečné na alkohol a
kyselinu fosforečnou:
Poločas vymizení: 4 dny.
V ČR se obvykle používá postup:
Reakce probíhá s EDTA plazmou v citrátovém pufru po aktivaci
chloridem sodným. Zastavení reakce je roztokem hydroxidu sodného, aby bylo
možné měřit žluté zbarvení nitrofenolátu sodného. Klasické provedení analýzy
lze uskutečnit v mikrotitrační destičce s reprodukovatelností
v sérii CV 1,27 – 1,5 % a mezi sériemi 2,26 – 4,0 %.
Ke stanovení aktivity ACP lze použít také 1-naftylfosfát:
Citlivost reakce lze zvýšit přidáním pentandiolu, který váže uvolněné
fosfátové ionty, aby neinhibovaly průběh vratné reakce. Rychlost diazotace
s 2-amino-5-chlortoluen-1,5-naftalen disulfonátem (Fast Red TR) závisí na
pH a před ustavením kinetiky nultého řádu se může objevit poměrně dlouhá fáze
prodlevy. Konečný produkt (diazobarvivo) není příliš stálý.
Reprodukovatelnost byla v sérii CV 3,9 – 8,3 %, mezi dny 2,6 – 16,0
%.
Poznámky k analytické metodě
Spektrofotometrie: Fenylfosfát jako
substrát se nepoužívá, protože vznikající fenol je jedovatý a kancerogenní.
Nejvíce se používá 4-nitrofenylfosfát. Popsány jsou také postupy používající
1-naftylfosfát, thymolftalein monofosfát a fenolftalein monofosfát. Hydrolýza
jednotlivých substrátů pomocí různých izoenzymů ACP probíhá rozdílnou
rychlostí.
Pro stanovení ACP
byly použity také různé imunochemické techniky jako IRMA, protisměrné
imunoelektroforéza, imunoprecipitace a enzymoimonometrická analýza.
V tomto případě se stanovuje hmotnostní koncentrace aktivních i
neaktivních molekul ACP.
Certifikovaný referenční materiál je
k dispozici pro prostatický izoenzym označením BCR 410 (Sigma-Aldrich).
Referenční metoda neexistuje.
Intraindividuální variabilita: 8,9 %, minimální signifikantní změna: 26,2
%.
Toleranční limit EHK: 21 % (pouze pro prostatický izoenzym).
Interference
Aktivitu
kyselé fosfatázy snižují: fluoridy, fosfáty, měď, oxaláty, tekutá mýdla (10 –
37 %), aj.
Aktivitu
kyselé fosfatázy zvyšují: bilirubin, hemoglobin, kyselina acetoctová, kyselina
gentisová, kyselina homogentisová, aj.
Další informace
Petr Štern, 2010-07-16