Synonyma

fosfát-monoester fosfohydrolasa, EC 3.1.3.1;

alkalická fosfomonoesterasa; fosfomonoesterasa;

glycerofosfatasa; alkalická fenylfosfatasa;

alkalická fosfohydrolasa; ortofosforečný monoester fosfohydrolasy.

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení AP (Google 8 440 000), případně ALP (Google 537 000).

Preanalytická fáze

Odebírat nalačno. Stabilita vzorku: 18 - 26 °C: 4 h (sérum), 2 dny (plazma – heparinát sodný), 2 - 8 °C: 3 dny, -20 °C: 4 týdny. Při rozmrazování se aktivita ALP zvyšuje. Při analýze lyofilizovaných sér po rekonstituci vodou nutno vyčkat > 90 min, jinak jsou výsledky vyšší !

Koncentrace ALP v erytrocytech je šestkrát vyšší než v séru a hemolýza proto výsledky měření falešně zvyšuje. Bilirubin tvoří diazoniovou sůl s α-naftylfosfátem a při fotometrii interferuje s p-nitrofenolem. Je-li vzorek při teplotě 56 °C 30 – 60 min, ztrácí ALP 80 -90 % aktivity.

Popis metody

Alkalická fosfatáza EC 3.1.3.1. je označení pro skupinu nespecifických fosfatáz, které katalyzují přesun fosfátové skupiny z jednoho hydroxylu na druhý hydroxyl:

reakce1

resp. hydrolýzu organických esterů kyseliny fosforečné na alkohol a kyselinu fosforečnou:

reakce2

Poločas vymizení: méně než 1 h (střevní izoenzym) až 170 h (placentární izoenzym). Nejvíce zastoupený kostní izoenzym přibližně 40 h.

Doporučený postup Expertního panelu pro enzymy National Committee for Clinical Laboratory Standards byl uznán IFCC. Zde je uvedena originální verze pro 30 °C (konverzní faktor z 30 na 37 °C je pro ALP = 1,33) , ale s přepočtem na µkat/min:

Činidla

1. MAP pufr (1,5 mol/l). Zkapalnění 2-metyl-2-amino-1-propanolu se docílí ohřevem na 30° až 35° C. Navážka 135 g se umístí do 1-litrové odměrné nádoby, přidá se 500 destilované vody a obsahem se zamíchá. Pak se přidá opatrně 190 ml 1 M HCl a po ochlazení na laboratorní teplotu se doplní destilovanou vodou do 1 litru. Zkontrolujte, že při 30 °C je pH 10,5. Uzavřený roztok je stabilní při 25 °C 1 měsíc.

2. Roztok octanu hořečnatého (3 mmol/l). V 1 litru destilované vody se rozpustí 650 mg octanu hořečnatého x 4 H₂O. Stabilita bez omezení při 4 °C.

3. Roztok p-nitrofenylfosfátu (24,5 mmol/l). V 10 ml MAP pufru se rozpustí 91 mg dvojsodné soli 2-nitrofenylfosfátu x 6 H₂O. Roztok je nutné připravovat denně čerstvý.

4. Standardní roztok p-nitrofenolu (1 mmol/l). V 1 litru destilované vody se rozpustí 139,1 mg p-nitrofenolu. Roztok je při skladování ve tmě stabilní po několik měsíců. Pro přípravu pracovního standardního roztoku se přidá 25 ml 1 M roztoku k 900 ml pufru MAP a doplní do 1 litru destilovanou vodou. Pracovní standardní roztok je stabilní alespoň 2 měsíce. Používejte tento roztok pro ověření molární absorptivity p-nitrofenolu při 403 nm.

Přístrojové vybavení

Jakýkoliv registrační spektrofotometr vybavený kyvetou s nastavitelnou teplotou je vhodný. Teplota by měla být udržována v rozmezí 30° C ± 0.1° C.

Pracovní postup

1. Přidejte 50 ml vzorku k 1,0 ml roztoku octanu hořečnatého. Intenzivně zamíchejte a inkubujte 5 min při 30° C.

2. Předehřejte pufrovaný roztok p-nitrofenylfosfátu na 30° C a přidejte 2,0 ml k inkubované směsi z bodu 1. Dokonale promíchejte.

3. Přelejte reakční směs do kyvety s optickou dráhou 1 cm a odečítejte absorbanci při 403 nm po dobu 2 min. Měření mohou být prováděna okamžitě po promíchání..

Výpočet

Aktivita je vyjádřena v mikromolech p-nitrofenoxidu vzniklého za minutu. Enzymova aktivita v µkat/l může být vcypočtena jako změna absorbance z následující rovnice (při délce optické dráhy 1 cm):

ΔA TV 10⁶

µkat/l = —— x —— x ——

Δt SV 60ε

kde ΔA je změna absorbance za čas Δt, TV je celkový objem, SV je objem vzorku, ε je molární absorptivita p-nitrofenoxidu (18,8 x 10³ litr x mol^-1 x cm^-1), 10⁶je faktor převádějící koncentraci na µmol/l, 1/60 je převod U/l na µkat/l).

µkat/l = ΔA/min x (3050 ml/50 ml) x 10⁶/18800 x 1/60 = ΔA/min x 54,08

Metoda je lineární přibližně do 8,3 µkat/l.

Další doporučený postup byl navržený Německou společností pro klinickou chemii také jako referenční postup. Tento postup používá jako pufr N-metyl-d-glukamin a je standardizován v ČR, SR a Itálii.

Činidla

1. N-metyl-d-glukamin (500 mmol/l). V přibližně 200 ml destilované vody se rozpustí 27,33 g metylglukaminu (560 mmol/l) a 1,15 g chloridu sodného (78,4 mmol/l, pH 10,6 při 20° C nebo 10,1 při 37° C). Pomocí 1 M HCl se nastaví pH na 10,5 a pak se přidá 30 mg tetrahydrátu octanu hořečnatého. Celkový objem se doplní na 250 ml destilovanou vodou. Roztok je stabilní při 20° C alespoň 2 měsíce v uzavřené láhvi.

2. p-Nitrofenylfosfát (20 mmol/l). V destilované vodě se rozpustí 4,16 g hexahydrátu dvojsodné soli p-nitrofenyl fosfátu a výsledný objem se doplní destilovanou vodou přesně na 50 ml. Příprava se provádí těsně před použitím a roztok musí být použit během 8 h při 20–25° C nebo během 24 h při teplotě skladování 3–5° C.

3. NaCl (155 mmol/L). V destilované vodě se rozpustí 0,9 g NaCl a výsledný objem se doplní destilovanou vodou na 100 ml.

Přístrojové vybavení

Jakýkoliv spektrofotometr vybavený kyvetou s nastavitelnou teplotou je vhodný. Teplota by měla být udržována v rozmezí 37° C ± 0.1° C.

Pracovní postup

1. Pipetujte 500 µl N-metyl-d-glukaminu do kyvety a přidejte 10 µL vzorku.

2. Důkladně zamíchejte a inkubujte při 37° C alespoň 300 s nebo dokud směs nedosáhne tuto teplotu.

3. Přidejte 50 µl p-nitrofenylfosfátu.

4. Zamíchejte a měřte vzrůst absorbance od 60. s při 405 nm.

Výpočet

Reagenční blank musí být odečtený od celkové změny absorbance:

(ΔA/Δt)_celková – (ΔA/Δt)_blanku = (ΔA/Δt)_korigovaná

Obě doporučené metody využívají stejné reakce:

reakce3

Toleranční limit EHK: 21 %.

Poznámky k analytické metodě

Normální hodnoty aktivity ALP závisí na použité metodě, věku (po 50. roku života hodnoty stoupají a to více u žen než u mužů), pohlaví, případně těhotenství (pokles hodnot ve 2. – 4. měsíci, ve 3. trimestru aktivita ALP vyšší 2 – 3-krát). U vegetariánů jsou normální hodnoty asi o polovinu vyšší.

Pro aktivitu enzymu je zapotřebí hořečnatých a zinečnatých iontů, jakož i serin. Proto je aktivita ALP významně inhibována při použití EDTA, oxalátu nebo citranu jako antikoagulancií. Výsledky také snižují cystin, cystein, fluoridy a vápenaté ionty. Použití glycinu jako pufru vede k vytvoření komplexu s hořečnatými ionty. Je-li použito činidlo s vysokým obsahem fosfátů, také to vede k inhibici měřené reakce. Jsou-li použity v činidle soli manganu, dochází k aktivaci enzymu. Přidání sodných iontů ve vhodné koncentraci (90 – 120 mmol/l) zvyšuje aktivitu ALP přibližně o 16 %.

Optimální pH reakce je mezi 9 – 10 a záleží na použitém pufru a substrátu. Nejvíce využívaným substrátem je p-nitrofenylfosfát, který je bezbarvá, zatímco reakční produkt p-nitrofenol intenzivně absorbuje při 403 nm. Transfosforylační pufry (2-metyl-2-amino-1-propanol – AMP, dietanolamin – DEA, tris(hydroxyaminometyl)metan – Tris, N-methyl-d-glukamin – MEG) významně zvyšují rychlost reakce vzhledem ke klasickým pufrům (veronalový, uhličitanový, glycinový). Jako akcelerátor reakce se někdy používá také manitol. Pufr AMP aktivuje více střevní než jaterní a kostní izoenzym.

Dalším používaným substrátem je α-naftylfosfát a detekce α-naftolu je při 340 nm (pH 10, uhličitanový pufr, přísada MgCl₂). Byly popsány i fenolftaleinmonofosfát a tymolftaleinfosfát.

Fluorimetrie používá 4-metylumbeliferylfosfát jako substrát a detekce 7-metylumbeliferonu se provádí při emisní záření 360 nm a excitačním záření 465 nm (uhličitanový pufr, pH 9,2). Kromě detekce fotometrem lze použít také HPLC postup s elektrochemickým detektorem (substrátem je fenylfosfát, detekovaný produkt je fenol).

Metoda s p-nitrofenylfosfátem a AMP pufrem je kandidátkou na referenční metodu Národní komise pro standardy v klinických laboratořích a expertního panelu pro enzymy (NCCLS/EPE) s CV v sérii 3 – 6 %, ale mezilaboratorní CV je 17 – 28 %.

Velmi důležitá je čistota transfosforylačních pufrů (zvyšují aktivitu ALP 2 až 6-krát). V DEA bývá významné množství monoetanolaminu (MEA). AMP může obsahovat inhibitory ALP jako jsou diaminy a 5-amino-3-aza-2,2,5-trimetylhexanol, které inaktivují enzym tím, že se vážou na zinečnaté ionty. Nečistoty se odstraňují zinečnatou solí kyseliny N-(2-hydroxyetyl)etylendiaminotrioctové. Pufr MEG (prof. Chromý) je jen průměrným akceptorem fosfátů, ale neobsahuje inhibitory jako aminoalkoholové pufry. Jeho výhodou ve srovnání s DEA je optimální pK = 9,63, téměř stejná reaktivita všech izoenzymů ALP a nízká viskozita.

V p-nitrofenylfosfátu může být obsažen p-nitrofenol (vysoký činidlový blank), nebo vzniká spontánně (činidlový blank), případně jsou přítomné fosfáty (inhibice reakce).

Je-li podíl séra v celkovém reakčním objemu 0,02 dochází při ředění k lepší disociaci agregátů ALP a tím k vyšší aktivitě enzymu. Linearita metod je obvykle v rozmezí 30 s – 15 min. Vzorky do aktivity 30 µkat/l lze zpracovat bez ředění. Doporučuje se start substrátem (v nutných případech vzorkem). Preinkubace do 5 min – možnost inaktivace kostní ALP !

ALP v prostředí MEG vykazuje o 30 % vyšší aktivitu než v AMP.

Certifikovaný referenční materiál viz Schiele F, Muller J, Colinet E, Siest G: Certification of an enzyme reference material for alkaline phosphatase (CRM 371) Clin Biochem 24:159-168, 1991.

Interference

Některé přípravky aktivitu alkalické fosfatázy snižují: azatioprin, cyklosporin (po počátečním přechodném zvýšení aktivity ALP), klofibrát aj.

Řada látek způsobuje zvýšení aktivity alkalické fosfatázy: aminoglykosidy, amiodaron, anopyrin, antikonvulsiva, aspirin (při dlouhodobém užívání), erytromycin, esterifikované estrogeny samotné nebo v kombibaci s androgeny (mohou také aktivitu snižovat !), etanol, fenobarbital, fenotiaziny, chlorpromazin, interleukin-2, izoniazid, levotyroxin, lithium, orální kontraceptiva, rytmochin II, spasmoveralgin, verapamil aj. Všechny léky vyvolávající cholestázu způsobují zvýšení aktivity ALP, které může být až desetinásobné.

Další informace

Principy analytických postupů

Petr Štern, 2010-07-16

Stanovení alkalické fosfatázy