Stanovení etanolu
Synonyma
ethanol, etylalkohol, ethylalkohol, EtOH
Preanalytická fáze
Vzorek může být plná krev (venózní nebo kapilární),
plazma (K2EDTA nebo heparinát sodný či lithný), sérum, vydechovaný
vzduch, sliny a moč. Vzorek musí být vždy dobře utěsněný. Mikroorganizmy
způsobují ztráty etanolu jeho oxidací na acetaldehyd. Fluorid sodný a chlazení
těmto ztrátám zabraňují. Kontaminace mikroorganizmy může vést i ke zvýšení
koncentrace etanolu, např. fermentace glukózy v moči kvasinkami. Pro
enzymové metody je třeba vzorek plné krve před analýzou deproteinovat.
Sliny jsou vhodný vzorek, neboť množství etanolu ve
slinách odpovídá hodnotám v plazmě a séru, pokud od pití alkoholu uplynulo
alespoň 20 min. Také vydechovaný vzduch odpovídá koncentraci alkoholu
v krvi (koncentrační poměr krev k vydechovanému vzduchu je 2100:1).
Stabilita
utěsněného vzorku (plazma, sérum) 18 – 26 °C: 2 týdny, 2 – 8 °C: 20 týdnů
(plazma, sérum), 30 dnů (moč), -20 °C: 3 roky.
Stabilita
utěsněného vzorku 22 – 29 °C resp. 0 – 4
°C (plná krev, plazma, sérum): 14 dní (Kaplan). Do vzorku moče je třeba přidat
1 % roztok dusičnanu fenylrtuťnatého.
Poznámky k
analytické metodě
Metody, které se používají ke stanovení etanolu jsou
nespecifické a semikvantitativní (osmolalita a difusní metody) a specifické a
kvantitativní (enzymové a chromatografické postupy).
Historické chemické metody byly obvykle založeny na oxidaci etanolu
dvojchromanem draselným nebo jiným oxidačním činidlem v silně kyselém
prostředí. Měřila se změna zbarvení při redukci dvojchromanu. Widmarkova
zkouška byla založena na destilaci etanolu a jeho oxidaci dvojchromanem.
Mikrodifusní metody jsou založeny na
stejném principu. Při tomto postupu proužek papíru ze skleněných vláken obsahuje
činidlo s chromovou kyselinou a při oxidaci uvolněného etanolu dochází ke
vzniku modře zbarveného oxidu chromitého (vzorek je ohříván na 80 – 120 °C). Většina
chemických metod je považována za zastaralé, protože mají nízkou specifitu,
jsou zdlouhavé a obtížně automatizovatelné.
Přítomnost alkoholu v séru vede ke zvýšení osmolality, je-li
měřena kryoskopickým postupem. V přítomnosti etanolu se zvyšuje rozdíl
mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou osmolality a to o 0,022 mmol/kg na 1 mg/l
etanolu. To je užitečné u akutní intoxikace pacientů etanolem, ale takto určená
koncentrace alkoholu může být nadhodnocena až o 30 %, protože etanol mění
stupeň disociace ostatních osmoticky aktivních látek (stejně se chovají i další
alkoholy).
Enzymové metody se používají nejvíce ke
stanovení etanolu. Ke katalýze se používá alkoholdehydrogenáza, která má ale
slabou křížovou reaktivitu s izopropylalkoholem (6 %), propanolem (1 %),
metanolem (3 %) a etylenglykolem (4 %); preciznost na analyzátoru CV 4 %. Metoda
je založena na oxidaci etanolu na acetaldehyd při současné redukci NAD+
na NADH. Reakce je sledována přímo při 340 nm fotometricky nebo lze použít
elektrochemické detekce, fluorimetrie či následné reakce NADH s tetrazoliovou
solí katalyzované diaforázou a měřit červené zbarvení jódnitrotetrazoliové violeti
při 500 nm. Použití proužků s enzymovými systémy vyvolávajícími barevné
reakce je možné jen pro koncentrace etanolu > 1 g/l.
Fluorimetrická modifikace sleduje inhibici fluorescence
fluoresceinu (volný reaktant) vznikajícím barevným produktem, tj.
jódnitrotetrazoliovou violetí. Přitom dochází ke zpětné oxidaci NADH na NAD+
katalyzované diaforázou a vzniklý produkt má také absorpční pík 492 nm, který
překrývá excitační a emisní spektrum fluoresceinu. Jódnitrotetrazoliovou modř
lze nahradit také lépe promývatelnou tiazolovou modří (nachové zbarvení 565
nm).
Elektrochemická detekce se obvykle používá
pro sledování etanolu ve vydechovaném vzduchu. Vydechovaný etanol se oxiduje na
palivovém článku, což vede ke vzniku volných elektronů a generovaný proud se
měří ampérmetrem.
Nejběžnější kvantitativní metoda sledování alkoholu ve vydechovaném
vzduchu je detekce infračervenou spektrometrií, výsledek je použitelný
ve forenzní medicíně. IR absorpce na začátku a konci komory se vzorkem udává
množství etanolu (vlnové délky C–H 3,4 µm a
C–O 9,5 µm). Selektivitu lze zvýšit přístroji používající k měření
až 5 vlnových délek.
Plynová chromatografie
s plameno-ionizačním detektorem je považována za referenční metodu,
preciznost CV 7 %. Chromatografie není tak oblíbená jako enzymové metody,
protože vyžaduje sofistikovanější zařízení a zkušenosti. Její hlavní předností
je simultánní detekce dalších těkavých látek jako je aceton, metanol a
izopropylalkohol. Používá se buď přímý nástřik zředěného vzorku (doba analýzy
10 min) nebo do kolony přicházejí jen jeho páry z hlavového prostoru
(delší postup – technika head-space). Při nástřiku celé krve se dává přednost
head-space, protože jinak je kolona poměrně rychle kontaminována.
Interference
Výsledky stanovení etanolu snižují: deficit proteinů, hemoglobin > 5
g/l, některé mikroorganizmy, thimerosal, aj. Výsledky stanovení etanolu zvyšují: aceton, etylenglykol, izopropylalkohol,
laktát, LD (vysoká), lipémie, metanol, n-propanol, některé
mikroorganizmy, aj.
Další informace
Petr Štern, 2010-07-16