Stanovení gentamicinu
Synonyma
Garamycin, gentamicinum, Gentamycin, Megental, Refobacin, Septopal
gentamicinium sulfuricum
Systematický název
(3R,4R,5R)-2-{[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-{[(2R,3R,6S)-3-amino-6-[(1R)-1-(methylamino)ethyl]oxan-2-yl]oxy}-2-hydroxycyclohexyl]oxy}-5-methyl-4-(methylamino)oxan-3,5-diol
Preanalytická
fáze
Stanovení
se provádí v plazmě (antikoagulans EDTA, heparin) nebo séru. Při
frakcionované i.v. aplikaci odběr 30 min po infúzi (maximum) a před další
aplikací (minimum). Při i.m. aplikaci 60 min po injekci (maximum) a před další
aplikací (minimum). Transportovat v chladu, odstřeďovat v chlazené
centrifuze. Existuje riziko adsorpce na separační gely.
Stabilita
vzorku 18 – 26 °C (sérum): 4 h, 4 – 8 °C
(sérum, plazma): 1 – 7 dnů, -20 °C (sérum): 4 týdny.
Pokud byl pacient současně léčen beta-laktamovými
antibiotiky, musí se sérum skladovat zmražené.
Gentamicin sulfát může být součást močových kamenů.
Poznámky k
analytické metodě
Imunochemické postupy jsou nejběžnější, nejvíce se
používá EMIT a FPIA. Dosud nebyla ustanovena referenční metoda.
Dříve se používaly mikrobiologické testy ke kvantitativní analýze
aminoglykosidů. Nejvíce se využívala difúze na agarové destičce. Standardy
antibiotika ředěné sérem se přidaly na disky filtračního papíru a také se
stejně zpracoval neznámý vzorek. Disky se inkubovaly 4 – 18 h
Mikroorganismy se staly viditelnými a vytvořily se zóny inhibice růstu o
různém poloměru podle koncentrace antibiotika. Podle standardů se určila
koncentrace v neznámém vzorku. Mikrobiologické metody jsou levné, ale
pomalé a jejich správnost je velmi proměnlivá, preciznost CV 5 – 50 %;
výtěžnost 88 – 125 %.
První imunochemický postup, který byl použit byla kompetitivní RIA.
Bakteriální enzym inaktivující gentamicin byl použitý k přípravě
radioaktivního konjugátu. Metoda je rychlá, ale poměrně pracná. Preciznost CV
13,0 – 20,6 %; výtěžnost 98 – 125 %.
Homogenní enzymová imunoanalýza EMIT používá při kompetitivní
reakci jako konjugát gentamicin s glukóza-6-fosfátdehydrogenázou. Volný
konjugát přeměňuje NAD+ na NADH a sleduje se nárůst absorbance při
340 nm. Preciznost CV < 10 %, vychýlení +2 %.
Při FPIA soutěží fluoresceinem značený vzorek a volný gentamicin o
vazebná místa specifické protilátky. Pouze konjugát vázaný na protilátku
poskytuje v polarizačním světle fluorescenční signál. Preciznost CV 1,7 –
2,7 %, vychýlení -5 až +4 %.
CEDIA využívá rekombinantní DNA
technologie, kdy donor a akceptor enzymu po spojení vytvoří aktivní
β-galaktosidázu, která reaguje s galaktopyranosidovým substrátem za
vzniku barevného produktu. Protilátka
proti gentamicinu zabraňuje vzniku aktivního enzymu (preciznost CV < 6 %,
vychýlení -8,5 %).
Delší popsané metody jsou bioluminiscenční imunoanalýza
s luciferázou a chemiluminiscenční analýza s esterem akridinu
jako značkou (preciznost CV < 6 %,
vychýlení -7 %).
Aglutinace také využívá kompetice
konjugátu gentamicinu s polysacharidem (ficoll) a gentamicinu ze vzorku o
protilátku vázanou na latexových částicích. Gentamicin ze vzorku brzdí
aglutinaci, která se sleduje turbidimetricky. Jiné uspořádání je konjugát
s latexem a volná fuzní králičí protilátka. V obou případech dochází
k inhibici zákalu gentamicinem ze vzorku. Preciznost CV 7 – 8 %, vychýlení -1 až -4,5 %. Při nefelometrické
inhibici se využívá v konjugátu vazby gentamicinu na bílkoviny a následně
vytvoření velkých komplexů s protilátkou rozptylujících světlo, jejichž
vznik inhibuje gentamicin ze vzorku.
HPLC předchází extrakce
antibiotika na CM-Sephadex. Analýza probíhá na reverzní fázi iontovou párovou
chromatografií s následnou postkolonovou derivatizací o-ftalaldehydem za
vzniku fluorescenčního produktu, který je detekován. Metoda je rychlá a přesná
(reprodukovatelnost CV < 5 %). Touto technologii lze stanovit i jednotlivé
izomery gentamicinu.
Toleranční rozpětí v EKK je 30 %.
Interference
Výsledky stanovení gentamicinu snižuje: heparin.
Výsledky stanovení gentamicinu zvyšují: bilirubin > 260 µmol/l,
hemoglobin, ikterus, lipémie, měď (intoxikace u novorozenců), netilmicin (až 25
% křížová reaktivita), sisomicin, aj.
Další informace
Petr Štern, 2010-07-16