Referenční materiály, metody a laboratoře

1. Referenční materiály - RM

Materiál/látka jejíž jedna nebo více hodnot veličin je dostatečně homogenní, má dobře určené hodnoty, je dostatečně stabilní a vykazuje potřebnou komutabilitu. U referenčních materiálů chemických složení je veličinou látkový obsah (látkové množství, koncentrace). Referenční materiál je fyzickou realizací (ztělesněním) jednotky měření. Prostřednictvím referenčních materiálů se realizuje návaznost výsledků měření, což je v podstatě správná realizace jednotky měření.

Role referenčních materiálů při měření je v zásadě dvojí:

přenos hodnot se zajištěnou návazností
hodnocení měřicích postupů

Přenos hodnot:

· kalibrace měření (rutinních i referenčních postupů)

· zajištění návaznosti hodnot referenčních materiálů nižší metrologické třídy přenosem hodnoty z materiálu vyšší třídy sledem řetězcem kalibrací

· zajištění návaznosti výsledku rutinního měření pomocí návazného pracovního kalibrátoru.

Hodnocení referenčních měřicích postupů:

· validace a verifikace správného provedení měřicího postupu

· stanovení hodnoty vychýlení

· vyhodnocení odhadu nejistoty měření

· posouzení výkonu laboratoří v programech EHK

Typy referenčních materiálů

· čisté substance látek s certifikovaným obsahem složky/složek a definovaným množstvím nečistot. Často používané k přípravě primárních referenčních materiálů.

· matricové materiály o matrici co nejbližší reálným vzorkům a pokud možno komutabilní

2. Klasifikace referenčních materiálů

Primární referenční materiály (PRM)

PRM představují nevyšší metrologickou třídu referenčních materiálů o nejvyšší kvalitě. Jejich hodnoty jsou přijímány bez dalšího srovnání s jinými referencemi (jejich vychýlení je považováno za nulové). Připravují se gravimetricky nebo volumetricky z čistých substancí. Slouží ke kalibraci referenčních měřicích postupů.

Certifikované referenční materiály (CRM)

CRM mají certifikované hodnoty měřených veličin. Certifikace je provedena referenčním měřicím postupem se zajištěním návaznosti na jednotky měření. Certifikované referenční materiály jsou vždy doprovázeny údaji o nejistotě jejich hodnot (obvykle se jedná o rozšířenou kombinovanou nejistotu). CRM jsou často matricového charakteru. Slouží k přenosu hodnot, návazných na jednotku měření na pracovní kalibrátory a také k hodnocení postupů a laboratoří, k validaci a verifikaci postupů, k odhadu vychýlení a nejistot měření.

Hodnoty PRM a CRM jsou určovány v kalibračních / referenčních laboratořích.

3. Certifikát referenčního materiálu obsahuje:

· plný název RM, jeho třídu (CRM,SRM^®, RM), šarži

· plný název a adresu certifikačního orgánu, jméno odpovědného pracovníka a kontakt na něho, kontakt na výrobce

· datum certifikace a datum exspirace certifikátu

· technický popis a oblast zamýšleného použití RM

· návod k použití

· podmínky a pokyny pro skladování a uchovávání během měření

· informace o homogenitě a stabilitě

· certifikované hodnoty, jejich nejistoty, metoda měření certifikované hodnoty, použité statistické metody

· údaj o zajištění návaznosti certifikované hodnoty k realizaci jednotky měření

· bezpečnostní údaje (analýza rizik použití, odpovídající bezpečnostní opatření).

Všechny uvedené údaje nebývají v certifikátu vždy uvedeny, ale jsou k nalezení v certifikační zprávě. Certifikační zpráva by měla být dostupná na požádání.

Nejistota certifikované hodnoty (U_CRM) bývá obvykle uváděna jako rozšířená nejistota na úrovni spolehlivosti 95% (k = 2).

4. Materiály kontroly kvality (QCM)

QCM, někdy také „in-house“ (v laboratoři, nebo pro laboratoř připravené) referenční materiály. Musí být rovněž dostatečně homogenní a stabilní a měly by mít co nejlépe určené hodnoty měřených veličin. Tyto hodnoty se však obvykle neurčují v referenčních laboratořích a bývá problém s úrovní jejich návaznosti. V zásadě je však i zde návaznost k jednotce vyžadována. QCM slouží zejména k provádění vnitřního řízení kvality (VKK) a k provádění externího hodnocení kvality (EQA, EHK) respektive ke zkoušení způsobilosti (proficiency testing - PT)). Do této třídy patří i kontrolní materiály výrobců. Jejich výrobci doposud často zcela rezignují na problém návaznosti, komutability a hodnoty měřených veličin vykazují velkou závislost na měřicím postupu i v případech, kdy je naprosto neodůvodněná.

5. Referenční materiály a Směrnice IVD 98/79 ES

Zásadním požadavkem na referenční materiály IVD jsou dokumentovaná návaznost a udaný odhad nejistoty jejich hodnot Role referenčních materiálů IVD jsou stejné jako v obecné analytické chemii:

· přenos návazných hodnot pomocí pracovních kalibrátorů

· hodnocení vychýlení výsledku měření

· příspěvek k odhadu nejistoty měření poskytnutím dat o nejistotách pracovních kalibrátorů.

Klíčovým problémem aplikace referenčních materiálů v IVD jsou:

· nedostatek referenčních materiálů pro řadu složek biologických materiálů z důvodu, že řada zejména proteinů není dostatečně definována

· problémy matricových efektů

· účelové, analyticky irelevantní a s koncepcí návaznosti nekonsistentní dělení referenčních materiálů na materiály, které jsou součástí Směrnice IVD (pracovní kalibrátory a interní kontrolní materiály výrobců) a na materiály, které do sféry zájmů Směrnice IVD nepatří (mezinárodně uznávané referenční materiály, materiály určené k účelům mezilaboratorních studií) – tedy non IVD výrobky

Zásady návaznosti hodnot RM, určených pro IVD jsou popsány normami ISO 17511 a ISO18153.

6. JCTLM - Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (Spojená komise pro návaznost v laboratorní medicíně)

Je orgán, jehož předmětem zájmu jsou:

· referenční materiály laboratorní medicíny

· referenční měřicí postupy laboratorní medicíny

· referenční laboratoře laboratorní medicíny.

JCTLM je součástí Mezinárodního úřadu pro míry a váhy se sídlem v Sévres u Paříže (BIPM) a odbornou expertní skupinou Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny (IFCC).

Referenční materiály mají v databázi JCTLM uvedeny tyto údaje:

· analyt

· matrici RM

· název/typ materiálu

· výrobce a kontakty na něj

· studie komutability

· literaturu

Referenční měřicí procesy mají v databázi JCTLM uvedeno:

· analyt

· název postupu/metody

· matrici, pro kterou lze postup použít

· měřicí princip

· literaturu

· výsledky porovnávacích studií.

Databáze lze nalézt na adresách

www.ifcc.org www.bipm.fr

7. Použití referenčních materiálů v procesech hodnocení výsledků měření

B - vychýlení (bias)

Diference průměru výsledků měření za podmínek opakovatelnosti C_x a certifikované (referenční) hodnoty C_RM – tedy hodnota vychýlení B:

Vychýlení je možné a často vhodné vyjádřit jako poměr průměru výsledků měření za podmínek opakovatelnosti C_x k certifikované (referenční) hodnotě C_RM.

R - výtěžnost (recovery)

Definici viz heslo - výtěžnost (recovery)

K exaktnímu výpočtu vychýlení jsou ideálním nástrojem certifikované referenční materiály. Ty jsou však většinou pro rutinní zdravotnickou laboratoř nedostupné (vysoká cena).

Referenční materiály použité a ověřené v programech EHK jsou velmi vhodným a (podle ISO Guide 35) regulérním nástrojem stanovení výtěžnosti. Někdy vadí absence odhadu nejistoty referenčních hodnot.

Vychýlení má být stanovováno s použitím série měření aspoň deseti vzorků (n = 10).

Certifikované referenční materiály poskytují hodnotu vychýlení, která je současně numerickým vyjádřením pravdivosti (trueness) měření.

Poznámka: Referenční materiály jsou účinným a nenahraditelným nástrojem verifikace měřicích postupů.

Odhad nejistoty vychýlení u _B nebo nejistoty výtěžnosti u _R

Nejistota hodnoty vychýlení pochází z následujících dat:

· nejistoty referenční hodnoty u_RM udané v certifikátu materiálu

· hodnoty opakovatelnosti, udané směrodatnou odchylkou s

· počtu měření dané velikostí série n

Přitom platí:

Stejně se počítá nejistota u _R, pouze namísto hodnot vychýlení B se dosadí hodnoty výtěžnosti R. Vždy je zapotřebí mít k dispozici nejistotu hodnoty referenčního materiálu

Porovnání výsledků měření s certifikovanou hodnotou

Mírou vychýlení je v tomto případě hodnota bias (rozdíl střední hodnoty výsledků měření od certifikované hodnoty).

Pro posouzení signifikance bias je možné použít některý z následujících postupů:

|B| < k . u_RM

kde je:

B ... bias (B = |x_e - x_c|, x_e je výsledek měření, x_c je certifikovaná hodnota)

k ... koeficient rozšíření (v praxi ve velké většině případů používáme hodnoty k = 2, což odpovídá zhruba 95% úrovni spolehlivosti)

u_e ... nejistota střední hodnoty výsledků měření

u_RM ... nejistota referenční hodnoty

SD_i ... intraindividuální biologická variabilita

SD_g ... interindividuální biologická variabilita

Posuzování výkonu

Výkon (který je podmíněn analytickou způsobilostí laboratoře) se posuzuje vyhodnocením výsledků laboratoří v mezilaboratorních porovnáváních zkoušek (zkoušení způsobilosti, externím hodnocení kvality).

Ideálním nástrojem posuzování je použití certifikovaných hodnot jako kriteria. Ty dovolí současně s výkonem a způsobilostí laboratoře vyhodnotit i pravdivost měření jako vychýlení od certifikované hodnoty. Certifikované hodnoty mají navíc k dispozici hodnotu svých nejistot, takže dovolují objektivní hodnocení a exaktní stanovení kriterií takového hodnocení (viz níže). Pokud nejsou certifikované hodnoty k dispozici (což představuje většinu případů), slouží jako vztažné hodnoty získané v programech EHK jako střední hodnoty účastníků (ALTM) nebo střední hodnoty skupin účastníků (ConV) používajících k měření stejného principu či měřicího analytického systému.

Výsledky a referenční hodnoty

Uvádíme několik způsobů, jak lze definovat matematicky, zda posuzovaná laboratoř má přijatelný nebo neakceptovatelný výkon:

a) Diference výsledku účastnické laboratoře (x) od vztažné hodnoty (X) nepřevyšuje cílovou nejistotu měření (TMU – target measurement uncertainty). Cílová nejistota by měla být zformulována jako obecně přijatý požadavek na kvalitu výsledků měření.To je základní, univerzálně použitelný způsob posuzování:

|x - X| < TMU

Pokud jsou k dispozici nejistoty měření v laboratořích účastníků (u_lab) a certifikované hodnoty s nejistotami (u_RM), lze výsledky účastníků posoudit podle vztahu:

b) Diference výsledku účastníka od vztažné hodnoty by neměla převyšovat nejistotu získanou kombinací laboratorní nejistoty u_exp a nejistoty hodnoty referenčního materiálu.

c) K posuzování výkonnosti by měly být použity referenční materiály s nejistotou vztažných hodnot U_RM menší než 1/3 hodnoty cílové nejistoty:

d) Pokud nejsou k dispozici nejistoty účastnických laboratoří ani vztažných hodnot referenčních materiálu, používá se jednodušších kriterií hodnocení:

kde s_exp je reprodukovatelnost zjištěná v mezilaboratorním experimentu, x je výsledek měření účastnické laboratoře a X je vztažná hodnota.

8. Komutabilita referenčních materiálů

Znamená stupeň shody (podobnosti) matrice referenčního materiálu s matricí reálných biologických vzorků. Nedostatečná komutabilita vnáší do výsledků měření špatně kvantifikovatelný podíl dodatečné systematické chyby. Obvyklé zdůrazňovaní matričních vlivů u kontrolních materiálů souvisí s jejich použitím při posuzování výkonů laboratoří v mezilaboratorních porovnáváních. Nicméně minimálně stejnou pozornost si zaslouží problémy komutability a matrice pracovních kalibrátorů měřicích postupů. Tyto pracovní kalibrátory mívají totiž charakter matričních interních referenčních materiálů a riziko nekomutability není u nich menší než u referenčních materiálů používaných k hodnocení výkonu laboratoří.

Hodnocení komutability je jednoduše proveditelné porovnáním poměru výsledků dvou měřicích postupů s použitím reálného vzorku (například směsi lidských sér bez přídavku jakýchkoliv aditiv) a referenčního materiálu. Hodnoty poměrů nemají být pro oba druhy materiálů signifikantně odlišné.

S výhodou se používá referenčních měřicích postupů a pak je mírou komutability porovnání hodnot výtěžnosti u reálného a referenčního materiálu (nemají být signifikantně odlišné).

9. Kalibrace, návaznost výsledků, metrologická návaznost hodnot referenčních materiálů

Fyzikální standardy, běžně používané při chemických měřeních jsou natolik dobře definované, dostupné a vykazující tak nízké hodnoty nejistot měření, že nepředstavují ve srovnání s chemickými měřeními prakticky žádný problém (standardy délky, hmotnosti, času, objemu, teploty, elektrických veličin). Obvykle stačí oficiální kalibrační certifikát a periodická verifikace, že fyzikální standard pracuje uvnitř intervalu garantované a požadované nejistoty). Hlavní problémy měření v chemických laboratořích jsou dány problémy se standardy chemického složení - referenčními materiály.

Kalibrace je proces, v němž jsou hodnotám látkového množství přiřazovány hodnoty odezev, indikované měřicím přístrojem.

Kalibraci lze realizovat nejvhodněji pomocí měřicích standardů – etalonů, uspořádaných do formy kvantitativní měřicí stupnice. Kalibrace je též proces, kterým se přenášejí hodnoty referenčních materiálů nejvyšší metrologické třídy přes referenční materiály nižších metrologických tříd až na pracovní kalibrátory.

Tento přenos je fakticky realizací návaznosti výsledku měření.

Kalibrační funkce (f_k) je definována vztahem mezi analytickou odezvou (y_a) a hodnotou obsahu či látkovým množstvím (x_a):

y_a = f_k (x_a)

Kvantitativní měřicí stupnice, která přiřazuje každé hodnotě y_a známé látkové množství x_g, dovolí transformovat kalibrační funkci na analytickou (f_a), kterou se vypočte látkové množství v neznámých vzorcích (x_a):

x_a = f_a (y_a)

· Kalibrátory mají podstoupit stejný měřicí postup jako neznámé vzorky

· Matricové kalibrátory (používané ve zdravotnické laboratoři nejčastěji) mají být dostatečně komutabilní

· Nejistota měření kalibrátoru silně závisí na počtu měřených vzorků – standardní nejistota průměru u_cal = s / Ön

· Efektivní kalibrace navazuje výsledek měření na referenci

· Bez kalibrace lze realizovat pouze primární analytické postupy, založené na možnosti konverze odezvy na látkové množství použitím fyzikálních zákonů (gravimetrie, titrace, coulometrie, hmotnostní spektrometrie)

· Referenční materiál, použitý ke kalibraci, nesmí být současně použitý k hodnocení (validaci/verifikaci) stejného měřicího postupu. Nutno použít jiné materiály tak, aby hodnocení a přenos hodnot byly z hlediska materiálů nezávislé

10. Přenos hodnot z jednotky měření až k rutinnímu měření ve zdravotnické laboratoři má ideálně tyto fáze:

· Ztělesnění jednotky měření bez porovnávání s jiným referenčním materiálem (příprava PRM gravimetricky nebo volumetricky)

· Přenos hodnoty jednotky pomocí referenčního měřicího postupu, kalibrovaného PRM na matricový referenční materiál s certifikovanými hodnotami - CRM

· Přenos hodnoty z CRM na pracovní kalibrátor obvykle současným použitím referenční a rutinní určené metody se současnou možností testování komutability

· Přenos hodnoty pracovního kalibrátoru, použitého v rutinním měřicím postupu na výsledek měření.

Další informace

Literatura I.

Metrologie chemických měření

Bedřich Friedecký, Josef Kratochvíla, Zdeněk Kubíček

recenze Zbyněk Plzák

Metrologie: Referenční materiály, metody a laboratoře