Principy měření krevních elementů na automatických analyzátorech

První stanovení, de facto založená na stejné filozofii jako měření analyzátory, bylo stanovení počtu elementů v počítací komůrce. Tento způsob je založen na spočtení krvinek rozptýlených v určitém malém objemu a přepočet na objemovou jednotku. Pro různé elementy se užívá různé ředění – erytrocyty jsou zastoupeny jinak než leukocyty a je nutné je více naředit. Pro počty trombocytů je zase nutné lyzovat erytrocyty, aby nedeformovaly konečný počet zakrytím trombocytů. Kromě různých ředění krve je možné ovlivnit vyšetření i objemem komůrky (Burkerova komůrka x Nageotova komůrka). Dodnes jsou takto stanovené počty krevních elementů využívány – transfuzní lékařství při sledování kvality deleukotizovaných preparátů (pokles počtu leukocytů o 3 řády). Jiné komůrky užíváme pro stanovení buněčnosti mozkomíšního moku (Fuchs-Rosenthal).

Hematologické analyzátory se řídí stejným principem – tedy stanovení počtu elementů v malém množství a přepočet na objemovou jednotku. Liší se přesností stanovení.

Rozdělujeme je dvou skupin

– poloautomaty, které vyžadují předředění vzorku obsluhou

– automaty, které nasají plnou krev a patřičné ředění provedou samy.

Základní principy měření počtu elementů:

1. Impedanční princip.

Měření probíhá v komoře kam je nasát vzorek naředěný vodivým diluentem. Přesně stanovené množství ředěného vzorku je pak pomocí vakua z této komůrky nasáváno malým otvorem, jehož průměr je srovnatelný s velikostí buňky. Otvorem (apertura) prochází stejnosměrný proud , který neproniká do cytoplazmy. Při průchodu buňky je z plochy apertury vytlačena část diluentu a změní se elektrický proud procházející aperturou. Tyto změny jsou snímány jako impulsy jejiž amplituda je přímo úměrná velikosti buňky. Analyzátor tedy současně s počtem impulsů – tedy s počtem procházejících buněk – změří i jejich objem. Počet impulzů v přesném malém objemu přepočte na objemovou jednotku a velikost impulzu zprůměruje a vydá ji jako střední objem buňky. Softwarem lze stanovit meze velikosti typické pro určité buňky a tak lze současně při průchodu jednou aperturou měřit více druhů buněk (erytrocyty a trombocyty).

Erytrocyty a trombocyty se stanoví ze stejného ředění vzorku a jsou odlišeny velikostí buňky.Za trombocyt je považována buňka velikosti 2 – 35 fl, větší jsou začleněny mezi erytrocyty. Leukocyty jsou stanoveny z menšího ředění a pro vyloučení rušivých vlivů erytrocytů a trombocytů je do naředěného vzorku přidáváno lyzační činidlo, které lyzuje všechny buňky (včetně leukocytů). Z leukocytů pak zůstanou jádra, která procházejí aperturou.

Počet impulzů a jejich velikost je roztříděna do 256 kanálů a graficky zobrazena ve formě histogramu. Je to křivka, kde na ose x je amplituda impulzu – objem buňky a na ose y počet stejně velkých impulsů – počet buněk. Ideálně má tvar Gaussovy křivky. Vyjímkou je histogram leukocytů, který tvoří vícevrcholovou křivku.

Impedanční princip je využíván v analyzátorech největší měrou. Jeho nevýhody vyplývají z něj samotného. Interference mezi různými typy buněk mnohdy vedou k falešným výsledkům a je nutné je znát a umět je odhalovat. Modernější automaty jsou schopny mnoho z těchto interferencí odhalit, nebo alespoň textovou zprávou (flagg) na možnost interference upozornit.

Nejčastější interference:

- leukocyty x jaderné erytroidní prekursory

- leukocyty x aglutináty erytrocytů při AIHA , paraproteinemii

- leukocyty x agregáty trombocytů

- trombocyty x úlomky erytrocytů

- erytrocyty x makrotrombocyty

- trombocyty x bakterie při sepsi

- trombocyty x nečistoty diluentu

- erytrocyty x aglutináty erytrocytů

Při kontrole výsledků je nutné věnovat pozornost histogramům, ze kterých lze mnoho interferencí vyčíst. Rovněž samotné výsledky – tedy statistické vyhodnocení nebo vypočtené parametry jednoho vzorku mohou pomoci (RDW, PDW – variační koeficienty velikosti erytrocytů a trombocytů, nebo MCH – střední obsah hemoglobinu v erytrocytu, MCHC – střední hemoglobinová koncentrace v erytrocytu).

Impedančně je měřen i tzv. třípopulační diferenciální rozpočet leukocytů, ve kterém jsou podle velikosti rozlišovány lymfocyty, monocyty a segmenty. Neumí rozlišit eosinofily a basofily. Je to vlastně leukocytární histogram, ze kterého dle předem stanovených velikostních rozmezí určuje podíly jednotlivých typů buněk.

2. Optický princip

Je využíván v novějších analyzátorech schopných stanovit pětipopulační diferenciální rozpočet leukocytů. Je založen na ovlivnění kvality a směru laserového paprsku průchodem buňkou. K tomu je nutné vytvořit velmi úzký proud buněk, ve kterém jsou seřazeny jedna za druhou. Paprsek je ovlivněn jádrem buňky a jeho přerušení znamená impuls vzniklý v optickém čidle. Opět musí být takto spočteny buňky v přesně odměřeném objemu. Optický počet je využíván jako druhý způsob měření počtu leukocytů a při měření retikulocytů na analyzátorech za pomocí intravitálního barvení.

Hlavním způsobem využití laseru je diferenciální rozpočet leukocytů.

Při jeho měření je využito schopnosti buněk lomit nebo polarizovat laserové světlo. Je několik systémů diferencování leukocytů.

Pouze optický – MAPSS ( Multi - Angle - Polarised - Scatter - Separation) – analyzátory Abbott.

Paprsek je snímán najednou několika čidly.

0°- počet buněk a velikost buněk,

10°-komplexita buňky- detekce mononukleárů

90°- členitost jádra a nepolarizace (neutrofilní granula v plazmě) a 90° členitost jádra a polarizace – eosinofily. Basofily nejsou pro tento systém granulocyty. Sheath (zjasňovací činidlo buněk ve vzorku pro diff) vyplaví obsah plazmatických granul a bazofily jsou snímány jako mononukleáry s laločnatým jádrem.Vytvoří ve skupině mononukleárů podskupinu stejně velkých buněk, obdobně jako lymfocyty a monocyty. Paprsek laseru nenachází v plazmě bazofilů překážky, které by jej lomily do 90°jako u ostatních granulocytů. Softwarově je pak informace z každého senzoru rozdělena do 256 kanálů dle amplitudy impulsu. Amplitudy do kanálu 23 ze senzoru 0° (malá velikost) jsou vyhodnoceny jako neleukocyty a nepromítnou se do celkového počtu leukocytů a do diferenciálního rozpočtu (na celkovém histogramu oblast N1 - pod čarou vlevo dole). Pokud je počet buněk v této oblasti větší než cca 3% leukocytů, bývá doporučeno mikroskopické zhodnocení - textová zpráva označující přítomnost nediferencovatelných buněk. Souhrnem informací o buňce ze všech senzorů je rozlišena každá buňka a zařazena do jedné z pěti populací leukocytů.

Z optického počtu bývají vyloučeny NRBC, nelyzované erytrocyty, velké destičky a shluky destiček (spadají do oblasti N1). V této oblasti bývají typicky uloženy NRBC a přístroj může vyjádřit i jejich přibližný počet na 100 leukocytů.

Obdobně stanovení retikulocytů optickou metodou spočívá v intravitálním obarvení (metylenová modř) a poté v analýze vzorku laserem. Erytrocyty jsou, pokud nejsou lyzovány Sheathem, zachyceny v čidle 10°a retikulocyty ještě lomí a polarizují světlo - registrace 90°. Tato dvojí registrace je pro retikulocyty s obarvenou RNA v plazmě typická a umožní určit procento retikulocytů ve změřeném počtu erytrocytů.Stanovení absolutního počtu je pouze přepočtem na počet erytrocytů.

3. Kombinovaný princip

VCS (Volume – conductivity – scatter) – analyzátory Coulter

Vzorek je lyzován speciálním lyzačním činidlem k odstranění erytrocytů. Potom je každá buňka hodnocena impedančně (volume), vysokofrekvenčním proudem (conductivity – vodivost plazmy) na charakteristiku obsahu cytoplazmy a laserem (scatter – rozptyl paprsku na buňce)analyzuje povrch a tvar buňky.

Cytochemický princip

K doplnění je nutné uvést i cytochemický princip diferencování – pomocí peroxidázového barvení (Advia 120 Bayer)

Peroxidáza je enzym katalyzující oxidační reakce peroxidem vodíku v buňce. Je přítomna v granulech buněk a její množství se zvyšuje se stupněm zralosti buňky. Největší množství je ve zralých neutrofilech a eozinofilech, v monocytech je mírně pozitivní a není přítomna v erytrocytech a lymfocytech.

Vzorek je v analyzátoru obarven na peroxidázu a poté intenzita zabarvení detekována laserem - tj. měření velikosti buněk, absorbce světla dle stupně probarvení plazmy a rozptyl světla - denzita a lobularita jádra.

Jinou látku užívá Pentra 80 - chlorazolovou čerň, která obarví jádra, granula a membrány a dále jsou leukocyty diferencovány laserem. K diferencování užívá cytometriii, cytochemi a impedanci k popisu buňky a světelná detekce systémem DHSS (double Hydrodynamic Sequential System)

4. Imunologicko - optický princip

Povrchový antigen buňky je při inkubaci označen monoklonální protilátkou s navázaným fluorochromem. Fluorochrom pohltí světlo laserového paprsku a vyzáří je na jiné vlnové délce. Použitím různých fluorochromů lze detekovat současně několik povrchových antigenů. Světlo fluorochromu je zachyceno senzorem, který je specifický pro určitou vlnovou délku. Kombinací informací z více senzorů je možné rozlišit a kvantifikovat jednotlivé buněčné populace.

Je to princip průtokového cytometru. Některé nejnovější analyzátory (CD4000) jsou schopny stanovení subpopulací lymfocytů a trombocytů na podkladě monoklonálních protilátek proti povrchovým antigenům značených flouorochromy .

Stanovení hemoglobinu

Je stanovován spektrofotometricky.

Měření se provádí z ředění vzorku určeného pro počítání leukocytů. Po ukončení počítání leukocytů je z lyzační komůrky převedeno přesně změřené množství vzorku do hemoglobinového fotometru. Zde je vzorek opakovaně změřen při vlnové délce 540 nm . Dle míry absorbce světla je možné určit množství hemoglobinu a přepočtem i jeho hladinu v původním vzorku plné krve. Stanovení je prováděno několikrát, nejnižší a nejvyšší hladina je z průměru vynechána. Po ukončení měření je komůrka vypláchnuta detergentem a ten je opět několikrát proměřován – určí tzv blank, se kterým je pak porovnávána absorbance světla vzorkem.

Lyzační roztoky se používají dvojího druhu. Roztoky pro starší typy analyzátorů obsahují kyanidy. Hemoglobin je jimi převeden v kyanidomethemoglobinový komplex a ten je detekován. U novějších přístrojů je využívána alternativní cesta bez kyanidů. Hemoglobin se převede na methemoglobinhydroxylaminový komplex, který je detekován stejně jako kyanidový.

Základní interference impedančně měřených hodnot

Leukocyty:

- jaderné erytrocyty – při lýze a průchodu aperturou se chovají stejně jako leukocyty, protože z nich zůstanou jádra. Analyzátory s pouze impedančním měřením leukocytů nemohou tyto buňky od sebe odlišit. Novější analyzátory stanovují počet leukocytů i opticky – odečtem v senzoru 0° a porovnáním s počtem buněk s lomem paprsku na 10 a 90° senzorech (ideálně tyto počty souhlasí). Normoblasty mohou být započítány do celkového počtu buněk ze senzoru 0°, ten je ale korigován počtem leukocytů z bočních senzorů. Optický počet leukocytů je potom menší než impedanční, což přístroj komentuje jako podezření na NRBC.

- opačně se mohou chovat rezistentní erytrocyty. Bývají nejčastěji u novorozenců, ale i u talasemií, drepanocytosa, erytrocyty u jaterních chorob (větší osmot. rezistence). Může se stát, že doba určená pro lýzu takových erytrocytů je krátká a některé erytrocyty nezlyzují. Potom mohou deformovat impedanční i optický počet leukocytů a diferenciál tím, že kromě zaregistrování buňky senzorem 0° i lomí světlo do senzoru 10°a imitují tím lymfocyty. Protože lyzační činidlo pro impedanční měření leukocytů je silnější než zjasňovač (Sheath), je zjasnění erytrocytů pro optický počet menší než pro impedanční, a optický počet leukocytů vyšší než impedanční,.Je ovlivněn i rozpočet, protože rezistentní erytrocyty mohou být detekovány jako lymfocyty. Analyzátor ohlásí přítomnost rezistentních erytrocytů a vzorek je potřeba přeměřit při prodloužení doby lýzy.

- leukocyty x agregáty trombocytů – agregované trombocyty nepodléhají dostatečně lýze a tak deformují impedanční počet. Optický počet je jiný a analyzátor může ohlásit NRBC.

- trombocyty x schistocyty – drobné úlomky erytrocytů o objemu menším než 35 fl jsou započítány mezi trombocyty. Pokud analyzátor neměří trombocyty ještě jinou metodou (opticky nebo imunologicky), lze na tuto skutečnost usuzovat pouze z tzv. interference na horním rozhraní. Při prohlídce histogramu je vidět atypický tvar křivky a nedostatečně snížený přechod v oblasti kolem 35 fl. Analyzátor hlásí interferenci a je nutné prohlédnout nátěr.

- aglutinace erytrocytů – deformuje výsledky někdy velmi silně. Bývá to při AIHA, paraproteinemii nebo při chladových protilátkách autoimunitního typu neprovázených hemolýzou. Aglutináty erytrocytů jsou odolné k lýze a zvyšují impedanční počet leukocytů. Optický počet ovlivní tak, že analyzátor je nedokáže zařadit a ohlásí nediferencovatelné buňky Protože lýza erytrocytů neproběhne dostatečně, může být snížena i hladina hemoglobinu. Je snížen počet erytrocytů protože aperturou prochází několik slepených buněk najednou. Roste MCV, MCH a MCHC na zcela nefyziologické hodnoty. Pomoci může histogram erytrocytů, ve kterém je vidět druhý vrchol v oblasti velkých objemů. Vzorek je nutné buď přeměřit v prodloužené lýze, nebo ještě před měřením pořádně promíchat.

- chylosita nebo ikterus velkého stupně mohou ovlivnit hladinu Hgb – lze vzorky naředit a snížit tím zákal či zbarvení na únosnou mez. Také vysoké počty leukocytů mohou interferovat s počty erytrocytů a je potřeba vzorky ředit. Většinou analyzátor tuto možnost nabízí, není ale vždy automatizována.

- Nečistoty nebo bakteriální kontaminaci systému odhalíme při změření pozadí

- makrotrombocyty x erytrocyty – velké destičky jsou určeny jako erytrocyty a pokud je k dispozici pouze impedanční počet, bývá i interference na horním rozhraní. Může být tak výrazně ovlivněn počet trombocytů u chorob s velkými destičkami (Bernard – Soulier) a jako jediná metoda spočítání je pak stará dobrá Burkerova komůrka. Mnohé analyzátory již tyto trombocyty odliší rozdíly v optickém (nebo imunologickém) počtu a impedančním.

Výpočty - MCH, MCHC

MCH - střední obsah hemoglobinu v jednom erytrocytu

MCH = Hgb/RBC * 10¹¹ (pg)

MCHC - množství Hgb v erytrocytární mase

MCHC = Hgb/Hct*1000 (g/l)

Eva Fenclová