Enzymologická diagnostika DMP je důležitá pro potvrzení příslušné
choroby a je podmínkou pro event. prenatální diagnostiku v postižené
rodině. Racionální a cílené enzymologické diagnostice předchází zhodnocení
klinických příznaků a výsledků pomocných vyšetření pacienta, výsledků analýzy
metabolitů v moči, séru, likvoru event. tkáních (autoptický materiál) a
ultrastrukturálních nálezů v bioptických vzorcích.
Odběr a transport
biologického materiálu
Biologický materiál vhodný pro průkaz deficitu specifického proteinu
(enzymu, proteinového kofaktoru, transportního proteinu) se liší jednak mezi
hlavními skupinami chorob, ale i v rámci jedné skupiny DMP a musí splňovat
určité podmínky. Důležitá je dostatečná exprese proteinu v analyzovaném
materiálu (pozor na tkáňově specifické proteiny).
Důležité je přesné dodržení instrukcí pro odběr, transport a zpracování
odebraného materiálu. Nerespektování těchto doporučení vede k inaktivaci
materiálu, který se stává pro finančně náročné enzymologické vyšetření nevhodný
a v důsledku nutnosti nového odběru, dochází také k opětovné zátěži
pacienta. Obecně by mělo platit, aby získání materiálu k analýzám, co
nejmíň zatěžovalo vyšetřovaného pacienta.
Pro enzymologickou diagnostiku DMP se nejčastěji používají leukocyty,
dále lymfocyty, trombocyty a erytrocyty izolované z periferní krve
odebrané do zkumavek s K3EDTA (izolaci je nutné provést
většinou do 4-12, výjimečně 24 hodin po odběru, podle typu izolovaných buněk).
Spolu se vzorkem krve od pacienta se odebírá i vzorek krve od kontroly (zdravý
jedinec přibližně stejného věku jako pacient), což je obzvlášť důležité v
případě transportu vzorků ze vzdálenějších míst. V případech, kdy je nutné
vzorek zpracovat okamžitě po odběru (např. u izolace trombocytů), je nutné
transportovat pacienta a odběr realizovat v blízkosti laboratoře, kde se vzorek
zpracovává a analyzuje.
Sérum a plazma jsou také vhodným materiálem pro stanovení aktivit
některých enzymů.
Pro diagnostiku některých enzymopatií je nutné založit kulturu kožních
fibroblastů. Tento materiál, uložený v bance zmražených tkáňových kultur,
je obecně velmi cenný a nenahraditelný v případech úmrtí pacienta
s nevyjasněnou diagnózou, pro event. dořešení v budoucnosti.
U některých diagnóz je možné enzymový deficit potvrdit jen na základě
stanovení enzymové aktivity v jaterní nebo svalové biopsii. V takovém
případě je nutné důkladně zvážit potřebu tohoto vyšetření, které je pro
pacienta zátěží. U některých DMP je nález na úrovni metabolitů tak charakteristický
a specifický, že již není nezbytné stanovit aktivitu příslušného enzymu. Někdy
se provádí přímo molekulárně genetické vyšetření, pokud je dostupné.
Provedení analýzy a
vyhodnocení výsledků
Spolu se vzorkem vyšetřovaného pacienta se současně analyzují vzorky
zdravých kontrol (jedna z kontrol je odebrána, transportována a zpracována
spolu se vzorkem pacienta) a vzorek od pacienta s již prokázaným deficitem
analyzovaného enzymu pokud je k dispozici. Aktivita tohoto enzymu ve vzorku
pacienta se pak srovnává s hodnotami aktivit zjištěnými ve vzorcích
kontrol. Kromě aktivity enzymu s podezřením na deficit je vždy nutné
změřit aktivitu kontrolního enzymu ve stejném materiálu. Toto je obzvlášť
důležité v případě prokázaného deficitu enzymu u pacienta, kdy je nutné
ověřit kvalitu analyzovaného materiálu. Nízká aktivita kontrolního enzymu je
známkou inaktivace vyšetřovaného materiálu a analýzy je nutné opakovat
v novém vzorku. Důležitým parametrem pro hodnocení u některých
metabolických poruch je i hodnota poměru aktivity analyzovaného enzymu
k aktivitě kontrolního enzymu.
Reziduální aktivita
enzymu pacienta a heterozygotní hodnoty
Reziduální aktivita deficitního enzymu u pacienta může představovat 0 –
20% průměru aktivit tohoto enzymu u kontrol. Heterozygotní hodnoty by ideálně
měly představovat asi 50% průměru enzymových aktivit u kontrol. Ve skutečnosti
často dochází k překryvu hodnot heterozygotů a kontrol, takže určení
heterozygotního stavu na základě stanovení aktivity enzymu nemusí být
spolehlivé. V některých případech může k vyjasnění situace přispět
analýza metabolitů (např. analýza glykolipidů v moči u přenašeček
klasické Fabryho choroby, MLD a deficitu aktivátorů sfingolipidových hydroláz),
ale hlavně analýza DNA.
Speciální problémy
diagnózy
V případě zjištění nízké aktivity enzymu in vitro
(s arteficielním substrátem) ve vzorcích zdravých klinicky
asymptomatických kontrol, které mají normální aktivitu kontrolního enzymu, se
většinou může jednat o tzv. pseudodeficit (s vazbou na určitý typ mutací). Problém
s interpretací výsledků může nastat v případě kombinace
heterozygotního stavu a pseudodeficitu, kdy aktivita sledovaného enzymu může
být kolem 20% průměru kontrol. V těchto případech k vyjasnění situace může
přispět zátěžový test provedený in vivo v kultivovaných kožních
fibroblastech s přirozeným substrátem, který je normálně degradován nebo
nalezení tzv. pseudodeficitní mutace molekulárně genetickými metodami.
Helena Poupětová, Evženie Pospíšilová, Hana Hansíková