Antinukleární protilátky

 

Antinukleární protilátky (ANP) je název, který je používán k označení celého souboru autoprotilátek, namířených proti orgánově-nespecifickým buněčným antigenům (Tab.1). Tyto autoantigeny velmi často plní v buňkách významnou funkci.

Systémová onemocnění jsou sice nejčastějšími situacemi, ve kterých se pozitivní ANP nacházejí, ale nízké titry lze nalézt až u 10 - 15 % zdravých osob a tato frekvence stoupá ke 20 - 25 % u osob vyššího věku. Většinou se však jedná o nízké koncentrace málo afinitních autoprotilátek izotypu IgM. Nízkými koncentracemi se rozumí pozitivní nález na HEp-2 buňkách v titru 1:40. Počet osob s vysokými titry kolem 1:320 se ve zdravé populaci odhaduje na maximálně 1%. Existují i případy s vyššími koncentracemi IgG autoprotilátek, s dosti značnou afinitou, bez přítomnosti zjevného onemocnění. To znamená, že pouhá přítomnost autoprotilátky nemůže být podkladem pro diagnózu onemocnění. Důležité je pátrat po výskytu systémového onemocnění v příbuzenstvu, protože frekvence pozitivity je zvýšena u zdravých příbuzných. Některé léky, jako jsou prokainamid, hydralazin, ale také některé betablokátory, chinidin, chlorpromazin, isoniazid, a-metyldopa, D-penicilamin, karbamazepin, timolol oční kapky či sulfasalazin mohou vyvolat vznik antinukleárních protilátek. Většina takových pacientů je klinicky asymptomatických a ANP vymizí po vynechání příslušného léku.  Poměrně známou příčinou pozitivity ANP jsou i chronická jaterní onemocnění, jako je chronická aktivní hepatitida, primární biliární cirhóza či chronické poškození jater alkoholem. Chronické parazitární infekce, tuberkulosa a lepra vyvolávají též vznik ANP. Pozitivní ANP se mohou vyskytnout i u chronických plicních nemocí, malignit, některých endokrinopatií, hematologických onemocnění a u roztroušené sklerózy.

V diagnostickém rozhodování je nutné brát v úvahu nejenom průkaz jedné autoprotilátky, ale také v jaké kombinaci se tyto autoprotilátky objevují, nebo nepřítomnost některé protilátky v kombinaci.

 

Detekce antinukleárních protilátek

Ve většině případů jsou antigenem velmi zachovalé struktury, takže autoprotilátky reagují, až na výjimky, s antigenními součástmi i heterologních buněk (např. myši, králíka atd.), což je možné využít při detekci těchto protilátek různými metodami.

Detekce jednotlivých druhů autoprotilátek je komplexní úkol, při němž je v ideálním případě zapotřebí využít několika testů, které se vzájemně doplňují, a interpretovat výsledky při znalostech předností a nevýhod jednotlivých metodik.

Mikroskopické vyšetření ANP nepřímou imunofluorescencí (FANP - fluorescenční ANP) by mělo být první screeningovou metodou, na kterou by v případě pozitivity mělo navazovat vyšetření ANP některou ze složitějších a přesnějších metod vedoucích k určení přesné autoprotilátkové specifity. V posledních letech se ukázal jasný přínos v použití lidských proliferujících buněk, jako jsou např. HEp-2 buňky, na kterých je možné odečítat různé typy fluorescence, tak, jak různé autoprotilátky reagují s různými komponentami buněk. Většina těchto obrazů neurčí jednoznačně některou z autoprotilátek, nicméně může napomoci při dalším vyšetřování (Tab. 2). Rozeznáváme 6 základních typů fluorescence: homogenní, periferní, skvrnitý, nukleolární, centromerový a cytoplasmatický, přičemž některé z nich mají ještě své podtypy (Tab. 2). Typ fluorescence závisí nejen na druhu protilátky, ale i na jejím množství. Ředění séra určuje semikvantitativně hladinu autoprotilátky. V současné době se doporučuje uvádět výsledky každého séra v ředění alespoň 1:40 a 1:160. První uvedený titr má vysokou senzitivitu a je pozitivní téměř u 100 % systémových chorob, ale zároveň také až u 31 % ”zdravých” jedinců. Titr 1:160 je výrazně specifickým ukazatelem, protože je pozitivní maximálně u 5% kontrolní populace, ale klesá zde zase procento záchytnosti u nemocných. Vždy je nutné hodnotit pozitivní nález v kontextu s klinickým obrazem nemoci a mít na zřeteli jiné stavy, které mohou vést k pozitivnímu nálezu.

 

Mikroskopické vyšetření nepřímou imunofluorescencí se také využívá k detekci protilátek proti dsDNA. V ČR se používá bičíkovec Trypanosoma danilewskyi, ve světě nejrozšířenější je test s Crithidia luciliae. Oba tito prvoci mají kromě jádra ještě tělísko zvané kinetoplast, které obsahuje čistou dvojvláknovou DNA. Prvok je fixován na sklíčku a jsou-li přítomny anti-dsDNA protilátky, vedou k imunofluorescenci kinetoplastu. Test je velmi specifický, ale nepříliš senzitivní.

K přesnější identifikaci autoprotilátky se používají imunodifuze a o něco citlivější protisměrná imunoelektroforéza. Tyto metody využívají precipitační reakce autoprotilátky s jaderným, resp. buněčným extraktem. Nejčastěji používaný extrakt se nazývá ENA (extrahovatelný nukleární antigen). ENA obsahuje rozpustné antigeny buňky, neobsahuje většinu komponent chromatinu a jadérka - z toho pramení, které protilátkové specificity je možné určit. Jsou to: anti-U1RNP, anti-U2RNP, anti-Sm, anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-P protein, anti-PCNA, anti-PM-Scl, anti-Ku, anti-Jo-1 a další tRNA syntetázy, anti-Mi-2 a někdy anti-Scl-70. Autoprotilátka obsažená ve vyšetřovaném séru vytvoří precipitační linii s ENA. Klasifikace autoprotilátky se provádí srovnáním s referenčními séry podle tvaru precipitační linie.

Velmi citlivou metodou k určení většiny autoprotilátek je imunobloting. Při této metodě je nejdříve směs buněčných antigenů rozdělena v polyakrylamidovém gelu podle molekulové hmotnosti a poté v elektrickém poli přenesena na nitrocelulózový papír. Působením vyšetřovaného séra na pásek nitrocelulózy s takto rozdělenými buněčnými antigeny dojde v pozitivním případě k vytvoření imobilizovaného komplexu autoprotilátka-antigen, který se projeví vznikem proužku či proužků, lokalizovaných podle molekulové hmotnosti antigenu. Určování ANP imunoblotingem umožňuje detekci autoprotilátek proti jednotlivým polypeptidům komplexních antigenů a odlišení různých autoprotilátek u polyspecifických sér. Navíc dovoluje určit autoprotilátky proti solubilním i nesolubilním antigenům, což je poměrně důležité, protože mnoho autoantigenů jsou relativně nesolubilní proteiny. Určitou nevýhodou je to, že během elektroforézy a při transferu rozdělených proteinů na nitrocelulózovou membránu dochází k denaturaci antigenu a ztrátě některých konformačních epitopů, což může vést v některých případech k falešně negativnímu výsledku. Vysoká citlivost imunoblotingu je zároveň další, i když relativní, nevýhodou, neboť identifikace pozitivních linií může být komplikována jejich počtem. Kromě známých, většinou poměrně snadno hodnotitelných autoprotilátek, se nachází asi 10 - 20 % výrazně pozitivních linií, které není možné identifikovat. Imunobloting je metoda, která spolehlivě detekuje autoprotilátky proti nRNP, Sm, P proteinu, PCNA, Jo-1, PL-7, Scl-70, PM-Scl, RA33, histonům, fibrilarinu, p80 - coilinu, centromerám a mitochondriím. U některých autoprotilátek (Scl-70, fibrilarin, RA33 a p-80 coilin) je to jediná metoda schopná tyto protilátky spolehlivě detekovat. Komplikovanější je situace u protilátek proti Ro a La antigenům, kde je nutno výsledek vždy ověřit protisměrnou imunoelektroforézou. Značná část anti-Ro protilátek rozeznává pravděpodobně konformační epitopy, které se během elektroforézy ztrácí a vedou k negativnímu, nebo velmi slabému výsledku. Na druhou stranu anti-Ro52 protilátky jsou prokazatelné pouze imunoblotingem nebo ELISA metodou.

V poslední době se  pro detekci autoprotilátek stále více využívá ELISA metoda, což je dáno tím, že většina základních jaderných a cytoplasmatických antigenů byla klonována v dostatečném množství ve formě rekombinantních proteinů. ELISA patří mezi nejcitlivější metody. Doporučuje se každou šarži souprav předem otestovat na senzitivitu a specificitu panelem známých, standardních sér. Samostatnou oblastí je ELISA pro detekci anti-dsDNA protilátek. Ta se doporučuje pro longitudinální sledování variace hladin anti-dsDNA protilátek, poté co byly anti-dsDNA protilátky zjištěny jinou, více specifickou metodou. ELISA pro anti-dsDNA protilátky bývá relativně často falešně pozitivní za situací, kdy jiné testy na detekci těchto protilátek jsou negativní a klinicky nejsou přítomny známky SLE.

V některých případech se k určení varianty ANP užívá radioaktivní imunoprecipitace. Jedním z imunoprecipitačních testů je Farrův test pro detekci anti-dsDNA protilátek. Zdrojem pro precipitaci je radioaktivně označená DNA, která je inkubována s naředěnými séry, se kterými v případě přítomnosti anti-dsDNA protilátek vytvoří imunitní komplex. Volná a vázaná DNA se potom oddělí precipitací. Poměr radioaktivity v precipitátu ku původní hodnotě udává stupeň vazby a tedy hladinu anti-dsDNA protilátek. Normální séra vážou určitou frakci DNA, maximálně však do 20%. Farrův test detekuje anti-DNA protilátky s vysokou afinitou. Imunoprecipitace se dá použít také k detekci protilátek proti jaderným a cytoplasmatickým ribonukleoproteinovým částicím. Nukleové kyseliny v kultivovaných buňkách jsou označeny pomocí ³²P ortofosfátu, proteiny pomocí ³⁵S-methioninu. Extrakt z těchto buněk je inkubován s vyšetřovaným sérem. Vzniklé imunitní komplexy jsou odděleny a podrobeny elektroforéze. Tato metoda je velmi senzitivní a specifická, je však vyhrazena specializovaným pracovištím.

 

 

Literatura

 

Crowe W, Kushner I. An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis Rheum 1977; 20:811-4.

Kurata N, Tan EM. Identification of antibodies to nuclear acidic antigens by counterimmunoelectrophoresis. Arthritis Rheum 1976;19:574-80.

DeRooij DJ van de Putte LB, Habets WJ, Verbeek AL, van Venrooij WJ. The use of immunobloting to detect antibodies to nuclear and cytoplasmic antigens. Scand J Rheumatol 1988; 17:353-64.

Vencovský J, Vidrnová M, Neužil A. Některé aspekty vyšetřování autoprotilátek proti buněčným antigenům u systémových revmatických onemocnění. Fysiat Věst 1992;70:23-8.

Vencovský J.  Antinuklerní protilátky. In: Pavelka K a kol. Laboratorní vyšetřovací metody v revmatologii. Knižnice ILF 1992, 1. vyd. Praha:58-66.

Vencovský J, Kafková J, Štork J. Antinukleární a anticytoplasmatické autoprotilátky u systémových revmatických onemocnění - vyšetření imunoblotingem. Čes Revmatol 1997;5:71-81.

Staněk D, Vencovský J, Kafková J, Raška I. Heterogenous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) C1 a C2 "core" proteins are targets for an autoantibody found in the serum of a patient with systemic sclerosis and psoriatic arthritis. Arthritis Rheum 1997; 40: 2172-7.

Vencovský J, Pešáková V, Kafková J et al. Přínos některých laboratorních vyšetření k diagnostice a hodnocení revmatoidní artritidy. Čes Revmatol 1999;7:155-65.

Bradwell AR, Stokes RP, Johnson GD. Atlas of HEp-2 patterns and laboratory techniques. The Binding Site Ltd 1995, 1. vyd. Birmingham, 118 s. 

 

 

 

 

 

Tabulka 1. Antigenní cíle v buňce, které jsou cílem pro antinukleární protilátky.

 

1. Chromatin - základními komponentami chromatinu jsou DNA, histony a malá množství nehistonových  chromozomálních  proteinů.

2. Jaderná membrána a póry

3. Jadérko - polypeptidy, někdy v komplexu s RNA, různé enzymy.

4. Ribonukleové kyseliny (RNA) - především RNA v komplexu s proteiny = ribonukleoproteiny (RNP).

5. Jaderná matrix - fibrilární kostra jádra.

6. Jaderná tekutina - obsahuje celou řadu rozpustných antigenů.

7. Různé součásti cytoplazmy - např. enzymy, ribozomy, RNA či RNP.

Tabulka 2: Typy fluorescence na Hep 2 buňkách, jednotlivé protilátky a jejich nejčastější výskyt při onemocnění.

 

Typ fluorescence                   ANP                                      Onemocnění

Homogenní                           anti-histonové                        SLE, RA, LI-SLE, JCA                                            anti-dsDNA                            SLE

Okrajový                                anti-dsDNA                            SLE                                            anti-laminové                         SLE

0Skvrnitý                                anti-U1 RNP                          MCTD, SLE                                            anti-Sm                                 SLE                                            anti-La                                  SS, SLE, vzácně RA                                            anti-Ro1                                 SS, SLE, neonatální lupus, řídce RA                                            anti-PCNA/cyklin2                    SLE                                            anti-Ku                                  SLE, PSS/DM                                            anti-Scl-70                             PSS

Nukleolární                                            anti-ribozomální RNP              SLE        homogenní                      anti-PM-Scl                            PSS/DM        chomáčkovitý                    anti-U3RNP                                            (fibrilarin)                               PSS        skvrnitý                            anti-RNA polymeráza I             PSS

Tečkovaný                             anti-centromerové                   CREST

Cytoplasmatický                                             anti-tRNA syntetázy                                            (Jo-1, PL-7,                                             PL-12 atd.)                             PM/DM                                            anti-ribosomální RNP              SLE                                            anti-Ro1                                 SLE                                            anti-mitochondriální                 PBC

Poznámky:

*Anti-Ro protilátky někdy neposkytují fluorescenci žádnou, někdy můžeme najít slabou cytoplasmatickou fluorescenci.

²Anti-PCNA/cyklin protilátky reagují pouze s určitým procentem buněk.

SLE - systémový lupus erytematodes, SS - Sjögrenův syndrom, PSS - progresivní systémová skleróza, PM/DM - polymyozitida/dermatomyozitida, CREST - limitovaná forma sklerodermie, PBC - primární biliární cirhoza, MCTD - smíšené onemocnění pojiva, JCA - juvenilní chronická artritida.

 

.