Chromatografi: stacionární fáze

Stacionární fáze v kapalinové chromatografii

Vedle účinných kolon a celkové kvality instrumentace rozhoduje o kvalitě separace při vysokoúčinné kapalinové chromatografii především použitý chromatografický systém, tj. kombinace stacionární a mobilní táze. S výjimkou chromatografie založené na iontové výměně nebo na sférické výluce dělených látek je relativní distribuce solutu mezi stacionární a mobilní fází určována řadou jevů, k nimž lze počítat adsorpci na tuhých sorbentech či na mezifázovém rozhraní, relativní rozpustnost solutu v obou fázích, specifické Interakce, solvataci či tvorbu asociátů nebo komplexů v jedné nebo v obou fázích, případně i další efekty.

 

Podle relativní polarity stacionární a mobilní fáze rozlišujeme chromatografii

·         v systémech s normálními fázemi (NP), kde je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní

·         v systémech s obrácenými fázemi (RP), kde má mobilní fáze větší polaritu než táze stacionární.

Toto rozdělení platí zcela obecně, jak pro chromatografii kapalina-kapalina, tak i pro chromatografii kapalina - tuhá fáze, pro kolonovou kapalinovou chromatografii i pro chromatografii v plošném uspořádání (tj. na tenkých vrstvách nebo na papíru).

 

Při kolonové kapalinové chromatografii v systému s obrácenými fázemi se jako tuhých stacionárních fází (sorbentů) používá především nepolárních uhovodíkových fází imobilizovaných na anorganických nosičích, je možno použít i čistého uhlíku, organických polymerů či náplní s chemicky vázanými arylovými či středně polárními (např. éterovými, nitrilovými či diolovými) fázemi a v čistě vodných fázích dokonce i nemodifikovaného silikagelu.

 

Jako mobilních fází se nejčastěji používá vodných roztoků jednoho čí více organických rozpouštědel (nejčastěji metanolu, acetonitrilu a tetrahydrofuranu). Pro separaci iontových látek či látek kyselé a bazické povahy je třeba k mobilním fázím přidávat pufry, neutrální soli, slabé kyseliny či látky vytvářející s ionizovanými soluty iontové asociáty. Velmi málo polární látky lze separovat l s použitím čistě organických mobilních fází (tzv. nevodná chromatografie v systému s obrácenými fázemi).

 

Aplikační možnosti chromatografie v systému s obrácenými fázemi na chemicky vázaných stacionárních fázích jsou velmi široké. Materiálů s chemicky vázanými nepolárními fázemi se často používá i při chromatografii na tenkých vrstvách.

 

 

Stacionární fáze chemicky vázané či imobilizované na anorganických nosičích

Jako nosiče pro přípravu chemicky vázaných fází se nejčastěji používají částečky silikagelu sférického či nepravidelného tvaru, tříděné na jednotnou velikost, se střední velikostí od 2 do 15 μm. Před chemickou modifikací se nosiče hydrotermálně upravují (zahřívají v autoklávu s vodou nebo vodní párou) a případně dále zahřívají s kyselinami, aby se z jejich .struktury odstranily mikropóry a aby se co nejvíce zvýšil počet volných silanolových skupin na povrchu nosiče.

 

Na povrchu silikagelu jsou přítomny hydroxylové (silanolové) skupiny bud volné nebo vzájemně vázané vodíkovou vazbou vedle nereaktivních siloxanových skupin. Chemická modifikace je možná pouze u volných silanolových skupin a proto je žádoucí, aby jejich počet na povrchu silikagelu byl co nejvyšší.

 

Chemické modifikace silikagelu při vzniku: A – monomerních B – polymerních alkylových vázaných fází

 

 

K vlastní chemické modifikaci a přípravě chemicky vázaných fází je možné využít různých chemických reakcí.

 

Chemicky vázanou fázi charakterizuje stupeň pokrytí povrchu nosiče (silikagelu), tj. počet modifikovaných silanolových skupin, který lze vypočítat z procentuelního obsahu uhlíku zjištěného elementární analýzou a ze specifického povrchu nosiče (silikagelu).

 

 

Chemicky vázané alkylové řetězce u "monomerních" fází mohou zaujímat různou orientaci:

1.       pokud jsou solvatované, řetězce "trčí" kolmo na povrch nosiče směrem do mobilní fáze, takže jejich vzhled připomíná kartáč,

2.       nedochází-li k solvataci, řetězce se "zhroutí" a vzájemně lnou k sobě, aby vystavovaly mobilní fázi co nejmenší povrch, jsou v tzv. "agregovaném" stavu. Orientace závisí na délce řetězců a jejich struktuře, teplotě a složení mobilní fáze a vysvětluje se působením tří faktorů:

a.       kohesivních interakcí mezi řetězci,

b.       solvofóbních interakcí mezi řetězci a složkami mobilní fáze (především vodou),

c.       interakcí vlivem tvorby vodíkových vazeb mezi zbytkovými nezreagovanými silanolovými skupinami a vodou (případně nižšími alkoholy) v mobilní fází.

 

Představa o sorpci solutů různé velikosti na chemicky vázaných alkylsilikagelových fázích monomerního „kartáčového“ typu S – molekuly solutů M – molekuly mobilní fáze C – chemicky vázané alkyly
Zhroucený stav	Solvatovaný stav

 

 

Čím větší je obsah organického rozpouštědla ve vodě a čím vyšší je teplota, tím snadněji zaujímají vázané řetězce "kartáčovou" orientaci.

V čisté vodě se nepolární alkylové řetězce nesmáčejí (nesolvatují), interakce vody se zbytkovými silanolovými skupinami mohou však stačit k vyvolání přechodu z agregátového stavu ke "kartáčové" orientaci řetězců, takže tato orientace řetězců u monomerních fází při praktických chromatografických podmínkách převládá.

 

Relativní retence, tj. poměr kapacitních faktorů dvou látek, které se liší velikostí nepolární části molekul, se zvyšuje s rostoucí délkou vázaných řetězců až po mez danou "kritickou" délkou řetězců, liší-li se molekuly látek svojí polární částí, závislost jejich relativní retence na délce vázaných alkylů se často vyznačuje i minimy a maximy a při určité délce vázaných řetězců může docházet i ke změně pořadí eluce.

 

V systémech s obrácenými fázemi se používají kromě uhlovodíkových i chemicky vázané fáze obsahující některé středně polární funkční skupiny, zejména nitrilové, esterové, éterové nebo nitroskupiny. Tyto skupiny přispívají k retenci určitých látek selektivními dipól-dipólovými, případně i proton-akceptorovými a proton-donorovými interakcemi.

Pro separace proteinů a dalších biopolymerů byly syntetizovány chemicky vázané fáze, které vedle nepolární části obsahují i hydrofilní skupiny (diolové, éterické apod.), které zlepšují smáčitelnost stacionární táze a tím i účinnost separace a omezují možnost denaturace biopolymerů.

 

RP-HPLC kolony a problémy s vodnou mobilní fází

Mezi nejčastěji používané patří HPLC kolony na bázi silikagelu s chemicky vázanou fází C18 popřípadě C8. Jejich oblíbenost je dána fyzikálně chemickými vlastnostmi silikagelu.

 

Poměrně často diskutovanou otázkou je životnost kolon a jejich stabilita, která závisí i na typu použité mobilní fáze. V konkrétních případech záleží stabilita kolon na typu silikagelu a na typu vázané fáze, ale zároveň i na pH mobilní fáze, na typu použitého pufru a typu organického rozpouštědla. Nedoporučuje se použití mobilní fáze v alkalické oblasti s pH > 8, kdy dochází k rozpouštění silikagelu, rychle klesá účinnost kolony a snižuje se výrazně i symetrie piku. Další omezeni je dáno stabilitou chemicky vázané stacionární fáze, kdy se obecně nedoporučuje používat kolony při mobilní fázi s pH < 2, protože dochází k degradaci stacionární fáze.

 

Pozornost si zasluhuje i mobilní fáze se 100%-ním obsahem vody, tj. bez podílu organického rozpouštědla. S tímto typem mobilní fáze se setkáváme při promývání kolon a při analýze některých látek. Promývání chromatografické kolony je třeba provádět při změně typu mobilní fáze, je běžné i před jejím uložením, kdy je třeba vymýt zachycené složky ze vzorků a případné zbytky pufrů. Ačkoliv je tento postup zdánlivě jednoduchý, skrývá v sobě řadu problémů.

 

Příklad:

Chromatografický systém je tvořen stacionární fází C 18 a mobilní fázi, například směsí vodného pufru a organického rozpouštědla (acetonitrilu  nebo metanolu).

Je známo, že nelze zaměnit mobilní fázi s pufry za 100% organickou fázi, protože by došlo k nežádoucímu vysrážení solí. Tento jev je důsledkem špatné rozpustnosti anorganických soli v organických rozpouštědlech.

Mění-li se dramaticky složení mobilní fáze, je doporučováno promytí kolony směsí vody bez pufru a organické fáze, a to ve stejném poměru jako v původně používané mobilní fázi. Podíl organické fáze by neměl klesnout pod 5%. Voda je sice velice účinná při vymývání solí z kolony, ale vzhledem k chemickým vlastnostem stacionární fáze není toto řešení ideální.

 

Jaroslava Vávrová