Blotting proteinů se stal neodmyslitelným postupem v molekulárně biologické i biochemické laboratorní klinické praxi. V roce 1975 E.M.Southern poprvé popsal přenos fragmentů DNA z agarózového gelu na nitrocelulózovou membránu pomocí kapilárních sil. Podle svého autora dostala metoda název Southern blotting. V roce 1977 Alwine a spol. Southernovu metodu modifikovali, použili místo nitrocelulózy diazobenzoyloxometylcelulózovou membránu, na kterou mohli přenášet i menší fragmenty DNA a RNA. Této modifikaci se začalo žertem říkat Northern blotting, tím také vznikl základ svérázné "geografické nomenklatury" blotovacích metod. Když totiž Towbin a spol. v r. 1979 elektroforeticky přenesli bílkoviny z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózovou membránu, bylo pro tento postup zavedeno označení Western blotting.

Základní výhodou blottingu je zvýšená dostupnost bílkovin po jejich přenesení na membránu. Bílkoviny jsou lokalizovány především na povrchu membrány, proto lze k detekci použít postupy nepoužitelné ve vlastním gelu. To se týká především imunochemických metod, kdy vysokomolekulární protilátky velmi špatně difundují do gelu. Na tenké membráně dochází navíc k zkoncentrování bílkovin, čímž se zvyšuje citlivost detekce. Bílkoviny jsou na membráně v imobilizovaném stavu, nedochází tedy k jejich difúzi, což umožňuje membránu uchovávat jistou dobu před vlastní detekcí a dává také možnost vícenásobné detekce z jediného gelu.

Blotovací postupy - podle síly použité pro vlastní přenos rozlišujeme:

· Difúzní

Při jednoduché oboustranné difúzi je z každé strany gelu umístěna blotovací membrána a několik vrstev filtračního papíru. Jednotka je sevřena porézním držákem a vložena do nádoby s pufrem na dobu 36 - 48 hodin. Výsledkem jsou dvě identické repliky. Účinnost postupu je až 75 %. Difúze však probíhá nejen ve směru přenosu, ale i do stran, tím se snižuje kvalita rozlišení vlastní elektroforetické separace.

· Kapilární

U kapilárního blotování je gel položen na porézní podložku a vrstvu filtračního papíru nebo buničiny umístěnou v nádobě s přenosným pufrem. Na povrchu gelu je umístěna blotovací membrána, jedna vrstva vlhkého a několik vrstev suchého filtračního papíru. Celá sestava je zatížena. Suchý filtrační papír nasává kapilárními silami přenosný pufr, přičemž jsou rovněž přenášeny bílkoviny z gelu na membránu.

· Vakuový

Uspořádání je obdobné kapilárnímu, přenosový pufr je nasáván pomocí vakua. Postup zvýší rychlost a účinnost přenosu ve srovnání s kapilární nebo difúzní formou blottingu.

· Elektroblotting

Blotování v elektrickém poli je nejúčinnější a nejrychlejší postup přenosu bílkovin. Podle provedení rozlišujeme tzv. "tankový" a "polosuchý" (semi-dry) způsob. Jako elektrody se používají grafitové desky neo nerezový plech. Blotovacích jednotek může být mezi elektrodami umístěno několik, aby nedocházelo k přenosu bílkovin mezi jednotlivými blotovacími jednotkami, jsou mezi ně vloženy dialyzační membrány. U obou typů elektroblottingu je nutné umístit blotovací membránu při dané polaritě napájecího napětí a daném pH přenosového pufru na správnou stranu gelu, záměna znamená ztrátu bílkovin.

Blotovací membrány se liší především typem interakce mezi svým povrchem a bílkovinami

· Nitrocelulóza

· Diazotované celulózové membrány

· Nylonové membrány - pozitivně nabité, vysoká vazebná kapacita, vhodné pro vysokomolekulární bílkoviny, nevýhodou je interakce s některými barvivy, což omezuje použití těchto barviv pro detekci

· Inertní membrány ze skelných vláken

· Hydrofobní polyvinyldifluoridové membrány

Další informace

· Immunoblotting

Jaroslava Vávrová