V souladu s mezinárodními úmluvami, ke kterým se Česká republika připojila, má být vyšetření mutací poskytováno výhradně na základě informovaného souhlasu (Úmluva na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny: Úmluva o lidských právech a biomedicíně, viz www stánky).
Principy molekulárně genetických technik, odběr vzorků apod. jsou popsány v jiných kapitolách.
Molekulárně genetické
vyšetření u probanda
Význam vyšetření
Metody molekulární genetiky jsou součástí vyšetření používaných při stanovení diagnózy. Znalost genotypu je základem individuálního přístupu ke každému pacientovi, v některých případech může mít znalost mutace význam pro predikci fenotypu nebo může ovlivnit volbu terapeutického postupu.
Strategie vyhledávání mutací
Ve většině případů jsou mutace v genech spojených s dědičnými onemocněními privátní, nelze se tedy spolehnout na vyšetření prevalentních mutací. Identifikace mutace v takovém případě není rutinní záležitostí, vyžaduje komplexní vyšetření celého genu, které zahrnuje přímé sekvenování PCR produktů pokrývajících celou kódující oblast genu, přilehlé intronové oblasti důležité pro správný sestřih a část 5’ a 3’ nepřekládané oblasti. Často je třeba výsledek ověřit na úrovni transkriptu (např. sestřihové mutace, identifikace nestabilních alel apod.). Pro správnou interpretaci výsledků je často potřeba u pacienta sledovat i polymorfismy a haplotypy. Takové vyšetření je nákladné (obvykle 30 – 50 tisíc korun, náklady mohou být i vyšší).
Indikace k molekulárně genetickému vyšetření
Při plánování molekulárně genetického vyšetření je třeba zvážit, jaký přínos nám tato nákladná metodika může poskytnout. Např. u dědičných metabolických onemocnění, která jsou způsobená deficitem enzymů, jejich aktivátorů nebo transportních proteinů, se diagnóza běžně stanovuje vyšetřením proteinu nebo jeho aktivity. Analýza mutací obvykle nepřinese žádnou novou informaci a je indikována pouze v případech, kdy výsledky biochemického testu jsou sporné. Důvodem pro vyšetření může také být snaha vyhnout se u pacienta invazivnímu odběru vzorku pro biochemickou analýzu (např. biopsie ledvin), nebo potřeba predikovat fenotyp nebo možnou odpověď na terapii. Molekulárně genetické vyšetření je vždy indikované u genetických onemocnění, která nemůžeme řadit mezi enzymopatie a kde je vyšetření mutací jedinou možností jak potvrdit klinickou diagnózu.
Meze molekulárně genetického vyšetření
Mezi zásadní omezení molekulárně genetického vyšetřeni patří interpretace výsledků. V řadě případů, kdy v důsledku mutace dojde k posunutí čtecího rámce, ke vzniku předčasného stop kodonu, k rozsáhlé deleci nebo inserci, můžeme říci, že jsme našli mutaci, která s manifestací onemocnění souvisí. Přibližně v polovině případů nalezneme mutaci způsobující aminokyselinovou záměnu, u níž nelze jednoznačně říci, že je mutací patogenní. Existují určitá kriteria, která pro patogenitu mutace svědčí (mutace není přítomna v genu zdravých jedinců, segreguje s onemocněním v rodině, byla popsána u nepříbuzného pacienta se shodnou diagnózou, nachází se ve funkčně důležité oblasti proteinu, mění funkčně důležitý aminokyselinový zbytek). Ale ani funkční studie, která je považovaná za nejkorektnější způsob ověření patogenity mutace, nemusí vždy jednoznačně dát správnou odpověď.
Druhým problémem je, že molekulárně genetické vyšetření nemusí mutaci odhalit. Takový výsledek nelze interpretovat jako vyvrácení klinické diagnózy. Jsme limitováni současným stavem poznání lidského genomu i metodami, které k vyšetření používáme (sekvenování genu, který má dvě kopie, odhalí malé změny, velké delece nebo inserce mohou zůstat neodhaleny).
Molekulárně genetické
vyšetření u rodinných příslušníků
Význam vyšetření
Nezastupitelnou úlohu hraje molekulárně genetická diagnostika v genetickém poradenství.
Analýza mutací je nejspolehlivějším a mnohdy jediným způsobem identifikace přenašečů a presymptomatických jedinců v postižených rodinách. Znalost predispozice k nemoci umožňuje zavedení preventivních opatření, např. změna životního stylu nebo zahájení farmakoterapie.
Zvláštní zřetel je třeba brát na identifikaci přenašeček v rodinách s gonozomálně recesivními onemocněními. Ženy, přenašečky mutovaného genu, mají 50% riziko, že jejich syn bude nemocí postižen. Přitom samy nemusí manifestovat příznaky onemocnění a biochemické vyšetření je u nich vzhledem k jevu X-inaktivace nespolehlivé.
Meze molekulárně genetického vyšetření
U členů rodin jsou vyšetřovány pouze mutace nalezené u probanda (nejčastěji přímým sekvenováním PCR příslušného produktu, případně technikou založenou na PCR-PCR/RFLP nebo ARMS ). Jestliže se tedy u rodinného příslušníka objeví mutace jiná, naše vyšetření ji nezachytí. Riziko přítomnosti další mutace je však stejně vysoké jako v celé populaci.
Molekulárně genetické
vyšetření v prenatální diagnostice
Význam vyšetření
U některých onemocnění je mutační analýza jedinou možností diagnostiky. Například deficit OTC, nejčastější dědičné onemocnění močovinového cyklu, lze diagnostikovat na základě stanovení enzymové aktivity OTC ve vzorku z jaterní tkáně. Podezření na toto onemocnění lze vyslovit na základě výsledků vyšetření metabolitů v tělních tekutinách, nebo zátěžového testu s allopurinolem . Ani jedna z biochemických metod není pro prenatální diagnostiku vhodná. Známe-li však mutaci, která se v rodině s deficitem OTC přenáší, není vyšetření DNA z choriových klků nebo amniocytů problémem.
Meze molekulárně genetického vyšetření
Stejně jako v případě vyšetření rodinných příslušníků jsou vyšetřovány pouze mutace nalezené u probanda.
Další informace
Lenka Dvořáková
recenze Martin Hřebíček