Abstrakt
V tomto SOPT
dokumentu jsou uvedeny základní údaje
(popis přístroje, princip měření, příprava vzorků, obsluha a ovládání
přístroje, údržba, stručně klinický význam a hodnocení výsledků stanovení) o
přístroji AAnalyst 600, což je atomový absorpční spektrofotometr
s elektrotermální atomizací a korekcí pozadí využívající Zeemanův jev,
vyráběný firmou Perkin-Elmer.Tento přístroj umožňuje stanovení celé řady prvků.
V biochemických laboratořích se využívá především při stanovení koncentrace
stopových prvků biogenních (chrom, selen ...) i toxických (hliník, olovo,
kadmium, ...) v různých biologických materiálech (krev, sérum, moč, vlasy,
tkáně, ...).
Seznam
souvisejících dokumentů
Název
přístroje a identifikace
Atomový absorpční spektrofotometr
s elektrotermální atomizací.
Typ: AAnalyst 600
Výrobní číslo: Serial 4057 Com 5003548 Ident. B312 0084
Rok výroby: 1998
Adresa výrobce: Perkin-Elmer Corporation, 761 Main
Avenue, Norwalk, Connecticut 06859, USA.
Princip
Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) je
založená na měření absorpce monochromatického záření volnými atomy
stanovovaného prvku. Při absorpci energie se elektrony prvku excitují ze základního do excitovaného stavu.
Každý prvek má specifické uspořádání a počet elektronů a proto je pro
excitování každého prvku potřebná specifická energie představovaná zářením
určité vlnové délky. Aby prvek absorboval energii záření, musí být atomy
v atomizovaném stavu. Atomizace, tj. disociace chemických sloučenin na volné
atomy se u tohoto přístroje realizuje
při vysoké teplotě 1500 až 3000 °C zahříváním vzorku v grafitové kyvetě,
to je tzv. elektrotermální atomizace ETA
(jinými využívanými možností atomizace u přístrojů AAS jsou plamenová
atomizace v plameni acetylen-vzduch, hydridová technika, to je vytvoření a
poté tepelné rozložení těkavých hydridů a technika “studených “ par využívaná
při stanovení Hg). Zdrojem záření jsou
nejčastěji výbojky s dutou katodou zhotovenou ze stanovovaného prvku
(HKL=Hollow Cathode Lamp). Pro
náročnější aplikace se používají citlivější bezelektrodové lampy
(EDL=Electrodeless Discharge Lamp). Paprsek lampy prochází obláčkem volných
atomů vytvořených vypařením vzorku na platformě grafitové kyvety a volné atomy
stanovovaného prvku absorbují záření lampy. Úbytek záření, úměrný koncentraci
stanovovaného prvku ve vzorku, se registruje plošným polovodičovým detektorem,
citlivým v intervalu vlnových délek 190 až 850 nm. Vymezení vyžadované
spektrální čáry (částečně realizované již použitím HKL nebo EDL lampy) se
přitom zajišťuje monochromátorem (umístěným
mezi grafitovou kyvetu a detektor). Funkčním prvkem monochromátoru je
difrakční rovinná mřížka s profilovanými vrypy (Grating), na které se svazek
rovnoběžných paprsků s různými vlnovými délkami rozloží na spektrum,
z kterého se pomocí úzké štěrbiny vymezí potřebná úzká část registrovaná
detektorem. Přístroj je konstruován jako dvoupaprskový. Paprsek lampy je pomocí
otáčejícího se segmentového zrcadla (Chopper) rozdělován na vzorkový paprsek,
který prochází grafitovou kyvetou a srovnávací paprsek nasměrovaný přímo do
detektoru. Přístroj porovnává intenzitu srovnávacího paprsku I0 a vzorkového paprsku I. Je definována
absorbance A jako A = log (I0/I) . Absorbance je
podle Lambert-Beerova zákona v určitém rozsahu (lineární oblast)
úměrná koncentraci stanovované látky,
proto se tento princip nechá používat pro kvantitativní stanovení. Pro
odstranění negativního vlivu možných nespecifických absorpcí se používají různé
korekce pozadí (Background Corrector). Nejčastěji se používá (je používána i
v tomto přístroji) korekce pozadí využívající Zeemanův jev, tj. štěpení
energetických hladin v silném magnetickém poli.
Jinou možností je například korekce pozadí
využívající deuteriovou lampu, jako zdroj kontinuálního záření.
Vlastní stanovení probíhá během
několika-stupňového teplotního programu (multi-step temperature program). Každý
stupeň je charakterizován těmito parametry:
- teplota (temperature) – to je konečná teplota
dosažená v kroku
- doba dosahování teploty (ramp time) – čas
potřebný k dosažení nastavené teploty
- doba udržování teploty (hold time) – čas po
který se udržuje dosažená teplota
- průtok vnitřního plynu (internal gas flow rate)
Teplotní program se obvykle skládá z pěti
kroků:
1) Sušení (Drying) –dojde
k vysušení kapalného vzorku na povrchu kyvety
2) Spalování (Ashing) –
má za úkol separovat rušivou matrici od analytu
3) Atomizace
(Atomization) – vytvoří se volné atomy analytu
4) Čištění (Cleaning) –
vyčistí se kyveta pro analýzu dalšího
vzorku
5) Chlazení (Cooling) –
kyveta se ochladí
Správné nastavení teplotního programu je poměrně
náročná záležitost a zcela rozhoduje o kvalitě prováděného stanovení.
Definice
a terminologie
Charakteristická hmotnost je množství analytu
v pikogramech potřebné k vytvoření výšky peaku 0,0044 A při integraci
výšky, nebo 0,0044 A.s při integraci plochy. Používá se při AAS
s elektrotermální atomizací ( při AAS s plamenovou atomizací se
používá analogický pojem charakteristická koncentrace).
Absorpce (elektromagnetického záření) je snížení energie
záření při průchodu hmotou, které vede
ke zvýšení energie absorbujícího systému.
Detekční limit (LOD) je zde definován jako
koncentrace prvku, která dá poměr signálu k šumu, který bude roven 3.
Blank obsahuje jedno nebo více činidel použitých pro
přípravu vzorku, ale záměrně neobsahuje analyt.
Reslope tj. změna směrnice kalibrační křivky pomocí
jediného kalibračního standardu (vhodné pro malé úpravy parametrů kalibrační
křivky, ke kterým dochází při malých změnách podmínek v přístroji.
Místo
provádění postupu
Ústav klinické
biochemie a laboratorní diagnostiky LF UK a FN Plzeň, Alej svobody 80, 304 60
Plzeň
Bezpečnostní
aspekty a podmínky prostředí
Při práci s atomovým absorpčním spektrofotometrem
pracujícím s elektrotermální atomizací
jsou mimo jiné následující bezpečnostní rizika vyžadující zvláštní
zřetel a opatrnost ze strany obsluhy:
-
při zapojení korekce pozadí využívající Zeemanův jev se kolem přístroje
vytváří silné magnetické pole, které může akutně ohrozit osoby
s voperovanými kardiostimulátory eventuelně kovovými implantáty. Ani
obsluha se nesmí přiblížit do okruhu asi 60 cm kolem atomizátoru.
-
riziko toxických zplodin vznikajících při provozu atomizátoru – musí být
zapnuté funkční odsávání
-
riziko úrazu elektrickým proudem – při zapojení přístroje se nesmí
otevírat žádné kryty a zasahovat uvnitř, před každým zásahem je nutné odpojit
zařízení od elektrické sítě
-
riziko práce s infekčním biologickým materiálem – zachovávat
základní hygienická pravidla
-
riziko práce s kyselinami používanými pro před přípravu a ředění
vzorků
Teorie,
použití, předpoklady provádění postupu
Atomový absorpční spektrofotometr je univerzální
zařízení umožňující stanovit široké spektrum prvků v ohromné škále
materiálů. Touto univerzálností se podstatně liší od jednoúčelových
biochemických analyzátorů zkonstruovaných pro jedno nebo jen několik
konkrétních stanovení. Plyne z toho ovšem to, že jednotlivá stanovení
nejsou předem naprogramována a připravena výrobcem přístroje, ale že je musí
připravit, vyladit a validovat (ověřit) obsluha zařízení. K tomu musí znát
teorii dějů probíhajících při stanovení na principu AAS. Atomová absorpční
spektrofotometrie se vyznačuje poměrně vysokou selektivitou, která do určité
míry snižuje nutnost předběžného složitého upravování vzorků (separace,
extrakce apod.). Selektivita AAS ale bohužel není úplná a vždy je
zapotřebí prověřit a eventuelně
odstranit vliv možných interferencí. Každý používaný princip atomizace má specifické
spektrum možných interferencí vyplývajících z fyzikální podstaty dějů
probíhajících při atomizaci. Zde jen interference elektrotermální atomizace,
která sice dosahuje řádově až 100 násobně nižší meze stanovitelnosti než
plamenová atomizace, ale je také mnohem náročnější a komplikovanější
z hlediska možných interferencí a problémů. Interference se rozdělují na
dvě základní kategorie:
I. nespektrální
(to jsou ty, které ovlivňují formování a počet volných atomů stanovovaného
prvku)
II. spektrální (tj. ovlivnění absorpce
záření lampy jinými látkami než volnými atomy stanovovaného prvku).
I. Mezi nespektrální interference se počítají:
Tvorba karbidů (Carbide formation). Charakter materiálu povrchu
kyvety (grafit) způsobuje vznik
netěkavých karbidů některých prvků. Pro potlačení této nespektrální
interference se používají kyvety z pyrolyticky potaženého grafitu
(pyrolytically coated graphite tube), které na rozdíl od normálních grafitových
kyvet nemají porézní povrch, takže se omezuje kontakt vzorku s materiálem
kyvety (vzorek se nemůže dostávat dovnitř grafitu). Pyrolytická úprava povrchu
mimo to zvětšuje životnost a stabilitu kyvety.
Rychlý ohřev vzorku na stěně kyvety. Vzorek, který je
v kontaktu se stěnou kyvety se při elektrickém ohřevu stěny kyvety rychle
ohřeje, odpaří se a dostane se tím do
proudu chladnějšího inertního plynu. Toto náhlé ochlazení zpomalí atomizaci
odpařených molekul vzorku a tvorbu volných stanovovaných atomů. Tento typ
nespektrální interference řeší platforma (L´vov platform), což je grafitová
vanička vložená do kyvety, která má minimální kontakt (dotýká se pouze dvěma
hranami) se stěnou kyvety . Platforma se proto při ohřevu kyvety ohřívá
pomaleji, než stěny kyvety a vzorek, který se dávkuje do platformy, se tak
odpaří až když je ohřátý i inertní plyn v kyvetě a nedochází tak
k ochlazování a zpomalování atomizace vzorku.
Únik atomů před dosažením atomizační teploty. Některé formy
(sloučeniny) prvků vznikající během elektrotermálního atomizačního procesu jsou
natolik těkavé, že opustí prostor kyvety ještě před dosažením atomizační
teploty. Projeví se to poklesem naměřené koncentrace analytu. Jedním způsobem
řešení této interference je přidání vhodného modifikátoru matrice (matrix
modification), který stabilizuje analyt. Interferenci omezuje také použití
maximální energie v atomizačním kroku (maximum power atomization).
Atomizační teploty se tak dosáhne dříve, než analyt stačí opustit grafitovou
kyvetu. Poslední možností, která se většinou kombinuje s prvními dvěmi, je
zastavení vnitřního průtoku inertního plynu kyvetou v průběhu atomizačního
kroku (internal gas stop).
Různě rychlá tvorba volných atomů při atomizaci. Vlivem matrice
dochází k různě rychlému uvolňování atomů analytu z povrchu platformy
do prostředí kyvety. Je proto obecně vhodné používat integraci plochy (peak
area measurement), která odpovídá celkovému množství uvolněných atomů analytu,
na rozdíl od integrace výšky (peak hight), která odpovídá jen nejvyšší dosažené
koncentrace atomů během atomizačního kroku.
Posun základní hodnoty signálu (baseline drift). Během měření pomocí
integrace plochy je riziko posunu základní hodnoty signálu. Pro eliminaci
tohoto problému se používá funkce BOC (baseline offset correction), která
spočívá v tom, že hodnota základního signálu se proměří až bezprostředně
před atomizačním krokem.
II. Spektrální interference způsobují,
Absorpce pozadí ( Background Absorption). Sem patří většina
spektrálních interferencí. Je způsobována buď tím, že v důsledku
nedostatečně úzkého vymezení spektra
absorbují záření lampy i atomy jiného prvku s blízkou absorpční čarou,
nebo tím, že záření lampy absorbují i nedostatečně disociované molekuly
případně pevné částice přítomné v plameni. Vznik těchto nespecifických
absorpcí je v prvním případě omezován použitím kvalitního monochromátoru a
úzké štěrbiny vymezující vstup záření do detektoru, eventuelně použitím jiné
větší vlnové délky. V druhém případě použitím korekce pozadí. U plamenové
AAS většinou pomocí zdroje
kontinuálního záření (většinou deuteriové lampy pro kratší vlnové délky a
halogenové lampy pro oblast delších vlnových délek). Přístroj je konstruován
tak, že střídavě odečítá záření
kontinuálního zdroje a katodové lampy. Jako specifickou absorpci
(odpovídající koncentraci stanovovaného
prvku) vyhodnotí přístroj jen pokles
záření katodové lampy nedoprovázený poklesem záření kontinuálního zdroje.
Nespecifická absorpce totiž způsobí
úbytek záření obou zdrojů současně.
Korekce pozadí použitím kontinuálního zdroje
záření má svá omezení, sice většinou stačí pro aplikace plamenové AAS, ale pro
náročnější aplikace elektrotermální AAS
se více používají jiné principy, jako
například v tomto přístroji zabudovaná korekce pozadí využívající Zeemanův
jev, tj. štěpení energetických hladin v silném magnetickém poli, což při
pozorování v polarizovaném světle způsobí rozdělení specifického
absorbčního peaku na dvě nebo více symetricky umístěné složky. Nespecifická
absorbce pozadí přitom většinou není magnetickým polem omezena.
K redukci
absorbce pozadí se často přidávají modifikátory matrice, které se zaměřují na
ovlivnění průběhu spalovacího (ashing) kroku atomizačního procesu. Dosáhne se
lepšího oddělení analytu od balastu tím, že se buď zvýší těkavost matrice
(například přídavek NH4NO3 ke vzorku s vysokým
obsahem NaCl ), nebo sníží těkavost analytu (například přídavek Ni(NO3)2
při stanovení Se). Nyní se doporučují směsné modifikátory matrice jako Pd
+ Mg(NO3)2, které jsou do určité míry univerzální.
Určitou možnost redukce absorpce pozadí představuje
zmenšení objemu vzorku dávkovaného do kyvety. Zmenší se tím i množství
interferující matrice.
Emisní interference (emission interference). Vzniká vlivem
intenzivního světla, emitovaného grafitovou kyvetou či platformou při vysoké
atomizační teplotě, dopadajícího na detektor. Riziko této interference je
naštěstí vysoké jen u dlouhých vlnových délek (například stanovení prvků Cr,
Ca, Ba ). Vliv této interference omezuje dobře seřízená geometrie kyvety a
potom použití jen nezbytně nutné atomizační teploty
Kombinací všech technik a opatření uvedených u
nespektrálních i spektrálních interferencí se dosáhne stabilizovaného stavu
s minimem interferencí označovaného jako STPF (stabilized temperature
platform furnace). Dosažení STPF u moderních atomových absorpčních
spektrofotometrů umožňuje rutinní analýzu s minimem rušivých vlivů pro
většinu analytů i matric.
V některých zvlášť náročných aplikacích se
ale přesto pro odstranění či omezení interferencí musí přistoupit
k předběžným úpravám vzorku, jako je mineralizace (na mokré nebo suché
cestě, v otevřeném či tlakovém systému případně s využitím
mikrovlnného záření ETHOS-
mikrovlnný tlakový mineralizátor ),
extrakce do organických rozpouštědel
apod. Každý takový krok nejen prodlužuje čas potřebný ke získání
výsledku a zvyšuje cenu stanovení, ale i zvětšuje riziko případné kontaminace
vzorků (např. obsahem stanovovaného prvku v činidlech použitých při
mineralizaci), nebo naopak ztráty analytu (například vytěkáním při otevřeném způsobu mineralizace). Proto je snaha
použití těchto před úprav co nejvíce eliminovat. Daří se to i díky stále dokonalejší konstrukci přístrojů,
softwarovému vybavení a komerční dostupnosti referenčních materiálů s garantovaným
obsahem stanovovaného prvku a ekvivalentní matrici.
Nezbytným předpokladem provádění analýz principem
AAS je i dokonale zabezpečená preanalytická oblast. Vzhledem k nízkým koncentracím stanovovaným principem ETA-AAS
mohou mít nezanedbatelný vliv například
nečistoty v používaných odběrových nádobkách, kontaminace vzorků
z prostředí, například z kovové jehly používané při odběru krve,
ztráty analytu například absorpcí na stěny nádobky při delším skladování vzorků
apod. Toto představuje samostatnou rozsáhlou problematiku přesahující rozsah
tohoto dokumentu.
Specifikace
přístroje
Popis přístroje:
AAnalyst 600 je konstruován ve tvaru kompaktního
kvádru, z kterého vystupuje pouze dávkovač (autosampler) na otočné konzole umístěné zhruba uprostřed
přední stěny. Naopak dovnitř kvádru zasahuje dopředu otevřený prostor
s atomizátorem (Graphite furnace). Vlevo nahoře je nahoru otvíratelný
kryt prostoru (Lamp department) pro 8
HKL nebo EDL lamp. Hlavní vypínač je vlevo dole na přední stěně, všechny
ostatní připojovací elementy elektřiny, argonu i chladicí vody jsou na zadní
stěně. Samostatně je umístěn ovládací PC a tiskárna.
Technické údaje:
Hmotnost:
175 kg
Rozměry:
délka 110 cm, šířka 70 cm ( s autosamplerem 104 cm), výška 65 cm
Napětí : 220 V
Kmitočet: 50 Hz
Ovládání:
Kompletně pomocí PC s programem AA WinLab
pracujícím pod Windows 95.
Minimálně nutná konfigurace PC: mikroprocesor
Pentium 90 MHz, 16 MB RAM, 500 MB hard disk, CD-ROM
Doporučené umístění:
Teplota laboratoře: +15 až + 35 °C.
Vlhkost vzduchu: 20 až 80 % nekondenzující
Čisté prostředí bez kouře, vibrací a korosivních
par. Vyloučit přímý sluneční svit na přístroj a umístit přístroj
v dostatečné vzdálenosti od topení a alespoň 50 cm od stěny kvůli přístupu
k prvkům umístěným na zadní stěně přístroje.
Provozní údaje:
Optický systém:
dvoupaprskový
Monochromátor: 274
mm Littrow s automatickým výběrem a nastavením vlnové délky
Rozsah vlnových
délek: 190-870 nm
Difrakční mřížka:
1800 vrypů/mm
Plocha mřížky:
64x72 mm.
Šířka štěrbiny:
0.2, 0.7 a 2.0 nm
Detektor: plošný polovodičový detektor Hamamatsu Photronics s lepším poměrem signál/šum než má
fotonásobič
Korekce pozadí:
podélný AC Zeeman-efekt (LZE
=Longitudinal .. ) – odstranil nutnost použití polarizátoru
Magnety se
automaticky zapínají jen na dobu trvání atomizačního kroku.
Grafitové kyvety:
příčně vyhřívané (tranversely heated ) s integrovanou platformou na 50 µl
vzorku
Přídavná
zařízení
-Autosampler AS-800 buď s 146 nebo s 88 vzorkovými
pozicemi, umožňuje automatizovat veškeré potřebné
operace (například ředění, přídavky apod.), protože je plně softwarově
kontrolován.
Dávkovaný objem nastavitelný v rozsahu 1-99 µl v krocích
po 1 µl.
Promývací objem 1,3 ml fixně nastavený.
Minimální potřebný objem vzorku cca 0,1 ml.
-Tlaková láhev s argonem – minimální výstupní
tlak 300 kPa
-Chladící voda o teplotě 20 - 40 °C a průtoku
minimálně 2 L/min.
-PC odpovídajících parametrů a tiskárna nejlépe
laserová
-Odsávací ventilační zařízení (doporučený výkon
5400 - 8400 litrů/minutu) umístěné cca 70 cm nad stolem
(nad
grafitovou kyvetou). Odsávání nad kyvetou je důležité, protože chrání obsluhu
před působením
toxických zplodin a chrání
přístroj před vznikajícími korosivními zplodinami ;
Reagující
substance, nosná media, pomocná činidla
Argon, chladící voda
Spotřební
materiál
Grafitové kyvety, HKL nebo EDL lampy, nádobky na
vzorky do autosampleru, špičky automatických pipet, papír do tiskárna, barva do
tiskárny
Kalibrace
a kontrola činnosti
Atomová absorpční spektrofotometrie je srovnávací
analytickou technikou. Koncentrace vzorku je stanovena na základě srovnání
změřeného absorbančního signálu se signálem získaným měřením blanku a jednoho
nebo více kalibračních standardů. Naměřený signál blanku a kalibračních
standardů se nejdříve použije pro sestrojení kalibrační závislosti mezi
absorbancí a koncentrací. Potom se změří absorbanční signál vzorku a
koncentrace vzorku se vypočte z dříve ustavené kalibrační křivky.
Rovnice kalibrační křivky může sloužit
k výpočtu koncentrací vzorků v širokém rozsahu koncentrací.
Udávají se obecná pravidla pro volbu
koncentrací kalibračních standardů.
1. Praktická spodní mez
pro kalibrační křivku je přibližně 20-50 násobek detekčního limitu (LOD). Je
ovšem možné provádět analýzy pod praktickou spodní mez kalibrační křivky, ale
potom je obvyklé provádět opakování analýz vzorků a blanku.
2. Horní mez kalibračního
rozsahu je často omezena na šestinásobek lineárního rozsahu, pokud jsou pro
kalibraci použity alespoň tři kalibrační standardy. Pokud jsou používány pouze
dva kalibrační standardy, nebude rozsah použitelnosti kalibrační křivky větší
než trojnásobek lineárního rozsahu.
3. Při používání tří
kalibračních standardů by jejich koncentrace měly být zvoleny tak, že
koncentrace prvního je přibližně stejné hodnoty jako horní mez lineárního
rozsahu, koncentrace druhého je trojnásobek koncentrace prvního a koncentrace
třetího je šestinásobek koncentrace prvního (pravidlo 6:3:1)
4. Pro většinu stanovení
jsou vhodné tři kalibrační standardy, avšak programové vybavení dovoluje
použití až 15 kalibračních standardů. Další standardy by měly být vloženy mezi
standardy splňující pravidlo 6:3:1 tak, aby všechny koncentrace těchto
standardů byly rovnoměrně rozmístěny podél kalibrační křivky.
Program AA WinLab umožňuje zvolit při editování
metody tři základní typy kalibrační křivky:
-
lineární kalibrace procházející počátkem souřadného systému (nulovou absorbancí a
koncentrací). Rovnice pro tuto kalibrační metodu je: C = K1 A , kde C = koncentrace, A = absorbance a K1 = směrnice (slope)
-
lineární kalibrace neprocházející počátkem souřadného systému.
Blank je považován za první bod kalibrační křivky. Rovnice pro tuto kalibrační
metodu je: C = K1 A + K2 , kde K2 je úsek na
ose (intercept)
-
nelineární kalibrace procházející počátkem využívá složitější
“racionální” rovnici. Signál blanku je vždy měřen první a potom je automaticky
odečítán od všech následujících měření signálů,
V AA WinLab je zařazen i program pro změnu
směrnice (reslope), kterým lze provádět malé úpravy parametrů kalibrační křivky
pomocí jediného kalibračního standardu, čímž se korigují malé změny podmínek
v přístroji bez nutnosti proměření všech kalibračních standardů.
Naměřené kalibrace lze částečně editovat, tj. lze
například vypustit jeden nevyhovující standard apod., ale nelze zadat pouze
“teoretickou” kalibraci. Vždy se musí jednat o naměřené hodnoty. Tím je splněna
jedna ze zásad SLP, tj. omezení možných zásahů obsluhy.
Programové vybavení dovoluje používat i metodu standardních přídavků, což je
metoda která umožňuje analyzovat vzorky, u kterých má matrice značný vliv na
směrnici kalibrační křivky. Při použití této metody je analyzován vzorek
samotný a vzorek, ke kterému bylo přidáno známé množství analytu. Nalezené
absorbance jsou používány k zjištění směrnice kalibrační křivky pro každý
vzorek. Metoda standardních přídavků má ale svá omezení (kalibrace musí být
lineární, matrice musí mít stejný vliv na přidávaný analyt, jako má na analyt
přítomný ve vzorku ) a měla by být používána až jako metoda poslední volby.
Vhodnější je omezit vlivy matrice jinými způsoby (před úprava vzorku, jiné
podmínky atomizace apod.).
Kontrolu činnosti při měření je vhodné provádět
například eliminací malých změn programem reslope, vhodným zařazováním
standardních referenčních materiálů (SRM= Standard Reference Material),
vytvářením regulačních diagramů atd., viz
řízení jakosti.
Údržba
Údržbu přístroje
(jejíž potřeba je minimální) je možné rozdělit na následující oblasti:
-
Udržování celého exterieru přístroje v čistém stavu. Dle potřeby
otřít vlhkým hadříkem maximálně s trochou detergentu.
-
Výměna vzduchového filtru jednou ročně nebo dle potřeby.
-
Údržba atomizátoru ( čištění křemenných okének dle potřeby, seřízení
kyvet dle potřeby)
-
Výměna pojistek dle potřeby.
-
Čistění okének lamp dle potřeby.
Pracovní
postup
Vzhledem k tomu, že atomový absorpční
spektrofotometr je univerzální zařízení
umožňující zavádět široké
spektrum různých aplikací, je pracovní postup v detailech velmi variabilní odpovídající vždy konkrétní metodě zavedené
a validované (ověřené) obsluhou. V tomto dokumentu proto nejsou uvedeny
všechny možnosti, ale pouze rámcový stručně okomentovaný postup:
Veškerý postup je prováděn a řízen přes PC
s programem AA WinLab: Zapne se AAnalyst 600, zapne se PC a ikonou se spustí program AA Win Lab.
Vlastní analýze musí předcházet vytvoření a úprava
metody, protože v AAnalyst 600 nejsou žádné předem definované a připravené
metody. Jednou připravená metoda se již příště může vyvolat z paměti a
nemusí se opakovaně nastavovat.
I. Vytváření metod:
1. V nabídce “File”
se stiskne “New Method”. Objeví se text pro vytvoření nové metody.
2. V tomto textu se
vybere stanovovaný prvek a počáteční hodnoty parametrů.
3. V ikoně “Method
Editor” se vyberou a nastaví konkrétní hodnoty parametrů, které jsou vhodné pro
prováděnou analýzu.
4. Zkontrolují se ještě
jednou veškeré parametry a v nabídce “Edit” se stiskne “Check Method”. Přístroj provede kontrolu, zda jsou
všechny parametry odpovídající a slučitelné. V záporném případě se objeví
seznam chyb.
5. Uloží se metoda pod
vhodným jménem. V nabídce “File” se stiskne “Save Method As”.
6. Pomocí ikon se otevřou
a po pracovní ploše monitoru vhodně rozmístí potřebná okna (Výsledky (Results),
Kalibrace (Calibration), Ovládání (Manual), Kyveta (Furnace) a v nabídce
“File” se stiskne “Save Workspace”. Uloží se tak pracovní prostředí, které se
otevře při příštím použití metody a odstraní se tak nutnost opakovaného
nastavování pracovní plochy.
II. Vytvoření informací o vzorcích:
Pro úsporu plynů a provozního času HKL lamp, je
vhodné, při větším množství analyzovaných vzorků, předem připravit údaje o
vzorcích a nadefinovat do kterého souboru se budou výsledky ukládat.
1. V nabídce “File”
se stiskne “New Sample Info File” (nebo se použije přímo ikona “Sample Info”).
Objeví
se okno editoru
informací o vzorcích.
2. Vloží se údaje o
vzorcích (označení, pořadí analýz, jednotky výsledků, analytik,...)
3. V nabídce “File”
se stiskne “Save As Sample Info File...”. Napíše se jméno souboru a stiskne OK.
III. Příprava
systému k měření:
1.
Zapne se
odsávací zařízení.
2.
Otevře se
uzávěr na tlakové lahvi s argonem.
3.
Nastaví se
odpovídající průtok chladící vody.
4.
Vloží se
příslušná HKL nebo EDL lampa.
IV. Seřízení
polohy špičky kapiláry vzhledem k dávkovací dírce grafitové kyvety:
1.
V okně
kontroly kyvety (Furnace Control Windows)
se stiskne tlačítko “seřízení špičky” (Align Tip). Raménko autosampleru
se zvedne z proplachovacího systému a zůstane zvednuté.
2.
Stiskne se
tlačítko “nezajištěná poloha nad kyvetou” (Unlocked above tube). Raménko se
natočí nad dírku kyvety. Pomalu ručně se snižuje špička a dvěma šrouby na
držáku autosampleru se upravuje předozadní a pravolevé směřování špičky tak,
aby směřovala přesně do dírky kyvety.
Opět se klikne na tlačítko Unlocked above tube a na dotaz se uloží
nastavení.
3.
Stiskne se
tlačítko “do kyvety” (In tube) a tím se zkontroluje, že špička kapiláry správně
zajela do kyvety (stranově i výškově).
4.
Stiskne se
tlačítko “nezajištěná poloha nad vzorkovými nádobkami” (Unlocked above sample
cup). Raménko se natočí nad nádobky a ručně se upraví výška špičky
v nádobce. Nastavená poloha se uloží.
5.
Stiskne se
tlačítko”do nádobky” (In sample cup) a tím se zkontroluje správné nastavení
výšky špičky kapiláry v nádobce.
6.
Stiskne se
“Exit”
V. Měření.
1.
Vloží se
vzorky, standardy, blank a promývací roztok do příslušných poloh autosampleru,
tak jak jsou definovány v příslušném informačním souboru o vzorcích
(Sample Information File).
2. Při automatickém měření se postupuje dle
okna “kontrola průběhu automatické analýzy” (Automated Analysis Control), které
má dvě záložky: “Nastavení” (Set Up) a
“Analýza” ( Analyze).
V Set Up se nadefinují metody (Method),
stanovovaný prvek (Elem.), informační
soubor o vzorcích (Sample Info File) a pozice na dávkovači (Autosampler
Locations). Dále soubor pro ukládání výsledků (Results Data Set) a zda tisknutí
během analýzy (Print Log)
V Analyze se potom
mohou použít příslušná tlačítka:
·
“Analýza všech
roztoků” (Analyze All) – Přístroj analyzuje blank a všechny standardy
definované v metodě a vytvoří kalibrační křivku. Potom analyzuje všechny
vzorky.
·
Při nadefinování
více metod současně projede přístroj i další nadefinovaná stanovení ve
vzorcích.
·
“Změna směrnice” (Reslope) – Přístroj provede měření nadefinovaných
standardů a provede případnou změnu směrnice kalibrační křivky.
·
“Kalibrace” (Calibrate) – Přístroj analyzuje blank a všechny kalibrační
standardy definované v metodě. Kalibrační křivku je možné si prohlédnout a
případně částečně upravit pomocí textu (Edit Calibration Dialog). Vždy se jedná
jen o možnost vypuštění či zařazení některého měření, nikdy nelze ručně bez
měření nadefinovat celou kalibrační křivku.
·
“Měření vzorků” (Analyze Samples) – Přístroj analyzuje pouze vzorky.
·
Opakovaným stisknutím tlačítek se analýzy zastaví a v případě potřeby se tlačítkem
(Reset) vrátí na začátek měření.
3. Při ručním měření se
postupuje dle okna “kontrola průběhu ruční analýzy” (Manual Analysis Control
Windows), kde jsou k dispozici následující tlačítka:
·
“Analýza slepého vzorku” (Analyze blank) - Přístroj provede analýzu
slepého vzorku.
·
“Analýza standardů” (Analyze standard) – Přístroj analyzuje kalibrační
standardy. Výsledky se průběžně objevují v okně (Calibration). Kalibraci
lze částečně editovat.
·
“Analýza vzorků” (Analyze Sample)
·
Obdobně jako při automatickém měření lze provést i změnu směrnice výběrem
a proměřením (Reslope) standardu a další přístupné funkce.
VI. Vypnutí systému.
1.
Stiskne se
tlačítko “promytí autosampleru” (Flush sampler ). Tím se promyje proplachovací
systém.
2.
Ukončí se
program AA Win Lab a vypne se PC.
3.
Hlavním
vypínačem se vypne spektrofotometr.
4.
Uzavře se
přívod inertního plynu.
5.
Uzavře se
přítok chladící vody.
6.
Vyprázdní se
odpadní nádobka autosampleru.
7.
Vyjmou se
všechny vzorky a činidla z disku autosampleru.
Řízení
kvality
Atomový absorpční spektrofotometr AAnalyst 600
Perkin Elmer je zařízení umožňující (po
správném nastavení a nakalibrování metody) přesné a správné měření celého
spektra prvků principem AAS. Konečný výsledek měření může být ale významně
ovlivněn i faktory nesouvisejícími bezprostředně se správnou funkcí analyzátoru
(způsob odběru a skladování vzorků apod.). Nejjednodušší cestou zajištění
kontroly i těchto faktorů je vkládání kontrolních referenčních materiálů
založených například na matrici séra. Tyto materiály se analyzují současně s
každou měřenou sérií vzorků. Výsledky měření kontrolních referenčních materiálů
se zaznamenávají do regulačních diagramů a umožňují tak trvale sledovat
stabilitu (správnost a přesnost) měření. V případě překročení varovných či
regulačních mezí se okamžitě prověří situace a odstraní příčina chybného
měření. Data těchto kontrolních měření je možné uchovávat v jakémkoliv
laboratorním systému umožňujícím konstrukci regulačních diagramů. Vedle uvedené
interní kontroly kvality je laboratoř zařazená do externí kontroly kvality
(pravidelné kontrolní cykly firmy SEKK). Jakost stanovení je také zajišťována
pravidelnou údržbou, která je zaznamenávána do provozního deníku přístroje.
Klinické
údaje
Atomová absorpční spektrofotometrie se
v biochemických laboratořích používá především pro stanovení stopových
prvků v biologických materiálech. Za stopové prvky se v současné době
považují prvky, které se v lidském organismu vyskytují v koncentraci
menší než 1 g na kg hmotnosti. Stopové prvky lze dělit na esenciální ( železo, zinek, měď, chrom,
selen, jod, kobalt, mangan, molybden, nikl, fluor, cín, křemík, vanad),
neesenciální ( rubidium, stroncium, antimon) a toxické ( kadmium, olovo, rtuť,
hliník). Pojem esenciální a toxický ale nelze brát staticky. Tyto pojmy jsou
relativní a závisí na celé řadě dalších faktorů a údajů ( dávka, časová
dimenze, chemická forma, individualita organismu, interakce s jinými
látkami v prostředí atd.). Tento relativní pohled má obecnější platnost a
je velmi důležitý zvláště z hlediska prevence poškození zdraví způsobeného
buď nedostatkem, nebo naopak přebytkem určitého prvku (Literatura 1)
Problematika klinických vlastností jednotlivých
stopových prvků je uvedena v příslušné literatuře ( Například Literatura
3) a přesahuje rámec tohoto dokumentu.
U každého prvku je vhodné volit jen určitý druh
biologického materiálu, tj. například nepožadovat stanovení olova v séru
(Pb je převážně obsaženo v erytrocytech) . Stopové prvky se také liší
biologickým poločasem. U prvků s krátkým poločasem se
musí věnovat zvýšená pozornost správné
volbě doby odběru. Například při monitorování expozice rozpustným sloučeninám
Ni nemá smysl odebírat vzorek na stanovení Ni v moči ráno na začátku pracovní směny, kdy je jeho
koncentrace daleko nižší než na konci směny, ani týden po expozici, kdy je již
prakticky veškerý Ni vyloučen.
Poznámky
Jiné
související informace
Literatura
1) Senft, V., Kohout, J.
: Patří chrom mezi esenciální nebo toxické prvky? Čas.Lék.Čes. , 135, 1996,
s.150-154.
2) Senft, V., Racek, J.,
Kohout,J.: Stopové prvky v biologických materiálech. Preanalytické
zabezpečení. Čas.Lék.Čes. , 137, 1998, s. 240-243.
3) Senft, V., Rusňáková,
H., Racek, J.: Význam různých možností monitorování hladiny magnesia v
organismu. Klin.Bioch. Metabol. , 5, 1997, s. 92-93.
Appendixy
Specifikace některých nejběžnějších spotřebních
položek a vyměnitelných součástí:
- Grafitové kyvety ( Graphite tubes) B300-0409
- Grafitové kontakty (Graphite contacts) B300-0410
- Pojistky (Replacement fuses) B312-1303
- Raménko dávkovače (swing arm) B312-0923
- Hadička pro argon (gas tube) B050-8264
- Vzduchový filtr (air filter) B050-2706
Stručný
popis postupuOSN-E
Zapne se AAnalyst 600, PC a program AA WinLab pro
AAnalyst 600.
1. Vloží
se příslušná HKL nebo EDL lampa
2. Vloží
se (případně se zkontroluje) grafitová kyveta s platformou.
3.
Vytvoří se informační soubor o vzorcích a o pozicích na disku
autosampleru.
4. Seřídí se špička
kapiláry dávkovače na straně kyvety i na straně nádobek se vzorky.
5. Vloží se všechny
vzorky, standardy, blank a promývací roztok do dávkovače.
6. Otevře se uzávěr
tlakové láhve s argonem.
7. Nastaví se
odpovídající průtok chladící vody.
8. Zapne se odsávání nad
kyvetou.
9. Provede se měření buď
automaticky, nebo ručně.
10. Promyje se
autosampler. Vyprázdní se odpadní nádoba.
11. Vypne se program AAWin
Lab.
12. Vypne se AAnalyst 600
a PC a odsávání.
13. Uzavře se tlaková láhev
s argonem a přívod chladící vody.
Autorské
poznámky
Doporučení, recenze, schválení