OSN-SAbstraktOSN-E

Na imunochemickém principu založený test TRIAGE 8 umožňuje rychlé screeningové prověření eventuelní přítomnosti 8 skupin drog a zneužívaných látek v moči ( Amfetaminy, Barbituráty, Benzodiazepiny, Kanabinoidy, Kokain, Metadon, Opiáty a Tricyklická antidepresiva ). Test je sice pouze kvalitativní, takže výsledky se vydávají jen ve tvaru pozitivní nebo negativní, ale je velmi cenný při akutních klinických případech pro rychlost získání relevantních informací o pacientovi. Pro eventuelní soudní účely je nutné případný pozitivní nález prověřit nezávislou kvantitativní metodou, např. GC/MS, HPLC apod.

OSN-SVýčet analytů (entit)OSN-E

· Amfetaminy ( AMP ) v moči

· Barbituráty ( BAR ) v moči

· Benzodiazepiny ( BZO ) v moči

· Kanabinoidy ( THC ) v moči

· Kokain v moči ( COC )

· Metadon ( MTD ) v moči

· Opiáty v moči ( OPI )

· Tricyklická antidepresiva ( TCA ) v moči

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

Amfetamin v moči U_AMFETAM_* klíč 04898 v NČLP

Barbituráty v moči U_BARB_* klíč 07165 v NČLP

Benzodiazepiny v moči U_BENZOD_* klíč 08229 v NČLP

Kanabinoidy ( THC ) v moči U_CANNAB_* klíč 08497 v NČLP

Kokain v moči U_COCAINE_* klíč 04976 v NČLP

Metadon v moči

Opiáty v moči U_OPIATESC_* klíč 08903 v NČLP

Tricyklická antidepresiva v moči U_TRICANTD_* klíč 09065 v NČLP

OSN-SPrincipOSN-E

Test TRIAGE 8 pro rychlý screening drog v moči využívá patentovaný imunochemický postup AMIA (ASCEND MultImmunoassay ). Při testu AMIA soutěží chemicky značené drogy ( konjugáty ) ze setu s eventuelně přítomnými drogami v testovaném vzorku moče o vazbu na protilátku. Po krátké inkubaci v reakční komůrce ( kapalná fáze ) je reakční směs přepipetována na membránu detekčního pole ( pevná fáze ), kde se zbylé volné konjugáty navážou na monoklonální protilátku imobilizovanou na membráně. Promytím se odstraní nenavázané konjugáty a současně se odbarví pozadí detekčního pole, takže je možný vizuální odečet eventuelně vzniklých barevných proužků při pozitivním výsledku testu u některé ze sledovaných drog.

OSN-SDefinice a terminologieOSN-E

Set TRIAGE 8 Panel for Drugs of Abuse je dodávaný firmou MERCK buď po 25 kusech s katalogovým číslem 1.16678.0001 nebo po 10 kusech s katalogovým číslem 1.16678.0002. V setu je vždy i plastová pipeta a lahvička s promývacím roztokem.

Výrobce setu: Biosite Diagnostics Inc., San Diego CA ( USA ).

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky FN a LF UK Plzeň, Alej Svobody 80, 304 60 Plzeň

OSN-SBezpečnostní aspekty a podmínky prostředíOSN-E

Vzorky močí mohou být potenciálně infekční. Potenciální riziko představuje azid sodný přítomný v reagenciích setu, protože může s mědí nebo olovem potenciálně vytvářet explozivní azidy.

OSN-STeorie, použití, preanalytické požadavkyOSN-E

Test TRIAGE je určen pro rychlý screeningový průkaz některé z testovaných látek ve vyšetřované moči. Pozitivní nález je využitelný jen jako rychlý údaj užitečný například při akutní klinické situaci, vyžadující rychlé rozhodování kvůli špatnému zdravotnímu stavu pacienta. Pro soudní a podobné účely se musí pozitivní nález potvrdit nezávislou kvantitativní, specifickou metodou jakou je například plynová chromatografie ( GC/MS ), případně vysokotlaká kapalinová chromatografie ( HPLC ) apod.

OSN-SZnaky analytických metodOSN-E

Správnost výsledků testu byla prověřena na 800 vzorcích močí, z nichž 700 bylo pozitivních na nějakou ze sledovaných drog a 100 bylo negativních, tj. bez přítomnosti drog ve významné koncentraci. Sledován byl poměr pozitivní/negativní jednak u testu TRIAGE 8, jednak u citlivé GasChromatography/Mass Spectroscopy kvantitativní metody. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v kapitole Apendixy.

Specifičnost výsledků testu byla prověřována přídavky velkého počtu různých drog, drogových metabolitů i dalších látek do moči. V tabulce č.3 v kapitole Apendixy jsou uvedeny příklady látek ( jen anglické názvy) které dávaly pozitivní výsledky při překročení koncentrací uvedených v tabulce č.1. K setu je rovněž přiložena tabulka několika set různých látek, které dávaly negativní výsledek. Tato tabulka ale překračuje rozsah tohoto SOP dokumentu.

Tyto znaky, tj. správnost a specifičnost spolu s hodnotami cut of value, jsou hlavní údaje důležité pro posouzení relevantnosti výsledků tohoto kvalitativního screeningového testu.

Je vidět, že ne vždy byla stoprocentní shoda v poměru pozitivní/negativní mezi testem TRIAGE a kvantitativní metodou GC/MS. Z toho jednoznačně plyne, že test TRIAGE je možné využívat pouze jako kvalitativní orientační test nepoužitelný přímo například pro soudní účely. Pro ty je nutné případné pozitivní výsledky validovat pomocí jiné nezávislé kvantitativní a specifické metody. Kvalitativní výsledek screeningového testu TRIAGE 8 má však velký význam při akutních klinických případech především vzhledem k rychlosti získání výsledku.

OSN-SOdběr materiáluOSN-E

Potřebné množství moče se odebere do skleněné nebo plastové zkumavky.

OSN-SManipulace s materiálemOSN-E

Vzorek moče se může uchovávat v ledničce při +2 °C až + 8 °C po dobu dvou dnů. Pro delší skladování je nutné vzorek moče zmrazit na - 20 °C. Před vlastním stanovením je ale nutné nechat vzorky vytemperovat na teplotu + 15 °C až + 25 °C a řádně promíchat. Vzorky močí s velkým obsahem pevných částic je vhodné před testováním odstředit.

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Všechny potřebné pomůcky jsou obsaženy v setu:

· Testovací deska s reakční komůrkou ( krytou vysouvacím víčkem ) a detekčním polem s orientačními označeními je dodávána zatavená v plastové folii.

· Plastová pipeta na 140 µl.

OSN-SReagencieOSN-E

Všechny potřebné reagencie jsou obsaženy v setu :

· V reakční komůrce jsou:

a) Lyofilizovaná monoklonální protilátka proti hlavním metabolitům amfetaminu/metamfetaminu, barbiturátů, benzodiazepinu, kokainu, opiátů, kanabinoidů a tricyklických antidepresiv v proteinové matrici s 0,01 % azidem sodným ( bílá reakční kulička ).

b) Lyofilizované chemicky značené drogy ( konjugáty ) v proteinové matrici s 0,01 % azidem sodným ( červená reakční kulička ).

c) Lyofilizovaný Tris/Tris x HCl pufr 200 mmol/l ( žlutá reakční kulička ).

· V detekčním poli je monoklonální protilátka proti hlavním metabolitům amfetaminu/metamfetaminu, barbiturátů, benzodiazepinu, kokainu, opiátů, kanabinoidů a tricyklických antidepresiv imobilizovaná na membráně.

· V lahvičce promývací roztok obsahující kyselinu boritou ( 100 mmol/l ), chlorid sodný ( 150 mmol/l ), stabilizátor ( 0,02 % ) a azid sodný ( 0,02 % ).

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Plastové špičky k pipetě.

OSN-SKalibraceOSN-E

Kalibrace se neprovádí, protože screeningový test je pouze kvalitativní, tj. pozitivní výsledek znamená, že koncentrace dané drogy v testovaném vzorku je stejná nebo vyšší, než koncentrace uvedené v tabulce č.1 ( viz kapitola Apendixy ), zatímco negativní výsledek znamená, že daná droga v testovaném vzorku buď vůbec není, nebo je v koncentraci nižší, než jsou koncentrace uvedené v tabulce č.1.

OSN-SPracovní postupOSN-E

Otevřít reakční komůrku ( jamka s třemi kuličkami ) testovací desky a napipetovat do ní 140 µl vzorku moče pomocí plastové pipety přiložené k setu. Nechat 10 minut inkubovat při teplotě 15-25 °C. Špičku pipety vyhodit.

Po 10 minutách novou špičkou nasát reakční směs ( červená ) z reakční komůrky a pomalu ji napipetovat na detekční pole v místě označeném červeným trojúhelníkem. Počkat, až se reakční směs kompletně vsákne.

Nakápnout 3 kapky promývacího roztoku z plastové lahvičky, přiložené k setu, na detekční pole v místě označeném třemi kapkami. Počkat, až se roztok kompletně vsákne. Výsledek testu odečíst do 5 minut.

Při odečítání zkontrolovat, zda je barevný proužek u pozice POS ( přítomnost proužku v této pozici potvrzuje funkčnost a správnost provedení testu ) a zároveň zda není barevný proužek u pozice NEG ( přítomnost proužku v této pozici upozorňuje na nefunkčnost či nesprávné provedení testu ).

OSN-SDokumentace, zpracování a hodnocení datOSN-E

Výsledek testu je pozitivní, když se objeví barevný proužek u některé ze značek označujících jednotlivé drogy ( například u značky BZO pro benzodiazepiny ). Pozitivní test znamená, že v moči je označená látka přítomná v koncentraci stejné nebo vyšší než je koncentrace uvedená v tabulce č.1, viz kapitola Apendixy.

Výsledek testu je negativní, když se neobjeví barevný proužek v detekčním poli, a znamená to, že v testovaném vzorku moči jsou testované látky ve vzorku buď vůbec nejsou, nebo sice jsou, ale v koncentraci nižší, než jsou koncentrace uvedené v tabulce č.1.

OSN-SZpůsob vydávání výsledkůOSN-E

Výsledky se vydávají pouze jako negativní nebo pozitivní. Skutečné koncentrace je nutné stanovit jinou vhodnou metodou ( GC/MS, HPLC apod.).

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Kontrola kvality provedení testu a funkčnosti testovací desky je zajištěna při každém provedení testu dvěma pozicemi v detekčním poli:

POS : barevný proužek u této pozice znamená, že test je funkční a dobře provedený.

NEG : barevný proužek u této pozice znamená, že test není funkční, nebo byl špatně provedený.

Mimo to se doporučuje v intervalu asi 30 dnů kontrola pomocí referenčního materiálu obsahujícího definované koncentrace testovaných drog.

OSN-SKlinické údajeOSN-E

Amphetamin ( 2-amino-1-fenyl-propan ) i jeho metyl derivát Metamphetamin patří mezi stimulancia centrálního nervového systému využívaná pro dosažení lepších výkonů, kvůli dosažení pocitů euforie a agility. Dochází k návyku vyžadujícímu zvyšování frekvence a velikosti dávek. Potom nastupují možná rizika: vysoký krevní tlak, ztráta chuti, ztráta váhy, zvýšená teplota, srdeční poruchy, psychóza.

Barbituráty ( deriváty kyseliny barbiturové, jako například barbital ( 5,5-dietyl-barbiturová kyselina ), fenobarbital ( 5-fenyl-5-etyl-barbiturová kyselina ), hexobarbital ( 1,5-dimetyl-5-(1-cyklohexenyl)-barbiturová kyselina ) apod.) patří mezi sedativa využívaná například při bolestech hlavy, zubů, při poruchách spánku apod. Převládá orální aplikace. Vzhledem k rozšířenosti a snadné dostupnosti těchto léčiv dochází často k otravám buď nešťastnou náhodou ( záměna, děti apod. ), nebo při sebevražedných pokusech. Nebezpečná je kombinace s alkoholem.

Benzodiazepiny patří rovněž mezi široce rozšířená léčiva ( například preparáty Diazepam, Oxazepam ) zařazovaná do skupiny psychofarmak. Využívají se například k odstranění či snížení pocitů úzkosti a strachu nebo při léčení nespavosti. Při chronické aplikaci vzniká snadno závislost.

Kannabinoidy nejčastěji zastoupené tetrahydrokanabinolem ( 6´´-hydroxy-2,5´-trimetyl-4´´-amyl-di-benzo-pyran ), což je látka obsažená v indickém konopí Cannabis indica ( hašiš ), nebo v marihuaně. Nejčastější formou aplikace je kouření cigaret vyrobených z těchto rostlin. Patří mezi stimulancia centrálního nervového systému. Zařazuje se sice mezi tzv. měkké drogy, ale přesto dochází ke vzniku závislosti a s tím souvisejícími riziky ( symptomy úzkosti, vznik paranoi, deprese, halucinace, ...).

Kokain je alkaloid ( derivát atropinu ) získávaný z rostliny Erythroxylon coca pěstované v Jižní Americe. Farmakologicky se využíval například jako lokální anestetikum, ale protože stimuluje a vyvolává euforii patří mezi nejrozšířenější zneužívané drogy. Aplikuje se intravenózně, šňupáním ( snorting ) i inhalací par při zahřívání drogy ( smoking ). Metabolity v moči jsou zachytitelné do 2-3 dnů po aplikaci.

Metadon ( 6-dimetylamino-4, 4-difenyl-3-heptanon-hydrochlorid )má účinky podobné heroinu, ale méně intenzivní. Používá se při léčbě závislosti na heroinu i jiných opiátech. Aplikuje se orálně nebo intravenózně. Metabolizuje se v játrech v moči se zachytí metabolity.

Opiáty zahrnují morfin ( derivát fenanthrénu ), heroin ( diacetylmorfin ), kodein ( metyl éter morfinu ). V přírodní formě se získávají z máku Papaver somniferum , ale jsou vyráběny i synteticky. Používají se především jako bolest tišící léky. Vzniká rychle závislost a dochází k zneužívání těchto látek s veškerými následky ( nevolnost, zvracení, ospalost, zúžení zornic, křeče, poruchy dýchání až smrt v bezvědomí ).

Tricyklická antidepresiva skupina psychoaktivních léčiv ( například preparáty Imipramin, Amitriptylin, Trimipramin ) používaných při léčbě depresí i celé řady dalších onemocnění ( například poruchy spánku, bolesti hlavy apod. )

OSN-SPoznámkyOSN-E

OSN-SJiné související informaceOSN-E

OSN-SLiteraturaOSN-E

· Moffat, A.C.: Clarke Isolation and Identification of Drugs, Second Edition. The Pharmaceutical Press, London, 1986.

· Wirth, W., Gloxhuber, Ch.: Toxikologie für Ărzte, Naturwissenschaften und Apotheker. 4. durchgesehene Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1985.

OSN-SAppendixy

Tabulka č.1 viz kapitola Dokumentace, zpracování a hodnocení dat

MTD Metadon	300 µg/l	OPI Opiáty	300 µg/l
BZO Benzodiazepiny	300 µg/l	BAR Barbituráty	300 µg/l
COC Kokain	300 µg/l	THC Kanabinoidy	50 µg/l
AMP Amfetamin	1000 µg/l	TCA Tricyklická antidepresiva	1000 µg/l

Tabulka č. 2 viz kapitola Znaky analytické metodyOSN-E

Droga	Koncentrace	TRIAGE/GCMS Pozitiv/Negativ	Droga	Koncentrace	TRIAGE/GCMS Pozitiv/Negativ
MTD	>300 µg/l	59/0	AMP	>1000 µg/l	67/1
	<300 µg/l	0/102		<1000 µg/l	0/113
BZD	>300 µg/l	72/5	THC	>50 µg/l	70/0
	<300 µg/l	1/115		<50µg/l	0/101
COC	>300 µg/l	51/0	OPI	>300 µg/l	56/0
	<300 µg/l	0/100		<300 µg/l	0/100

Tabulka č.3 viz kapitola Znaky analytické metodyOSN-E

BZP :	Alprazolam	AMP:	Amphetamin	TCA :	Amitriptyline
	Bromazepam		Methamphetamin		Chlorpromazine
	Clobazepam		Phenethylamin		Clomipramin
	Diazepam	OPI :	Acetylmorphin		Imipramin
	Flunitrazepam		Codeine		Nortriptyline
	Nitrazepam		Ethylmorphin		Protryptiline
	Oxazepam		Nalorphine		Trimipramine
	Temazepam		Oxycodone	MTD :	Methadone
COC :	Cocaine	BAB :	Allobarbital	THC :	THC
	Ecgonine		Amobarbital

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

Nakápnout 3 kapky promývacího roztoku z plastové lahvičky, přiložené k setu, na detekční pole v místě označeném třemi kapkami. Počkat až se roztok kompletně vsákne. Výsledek testu odečíst do 5 minut.

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

OSN-SDoporučení, recenze, schváleníOSN-E

Drogy (Amphetamin, Barbituráty, Benzodiazepiny, Kanabinoidy, Kokain, Metadon, Opiáty, Tricyklická antidepresiva) v moči - rychlý screening