Abstrakt:

Moderní metoda separace volné a vázané frakce ligandu používaná v imunoanalýze. Je založena na vazbě jedné z komponent imunoanalytického systému na povrchu látky v pevném skupenství (povrch zkumavky, pevné partikule, folie atd.). Vazba ligandu nebo protilátky je buď fyzikálně chemické povahy (sorpce), nebo je zprostředkována chemickou vazbou. Vazbou jednoho z ligandu na pevnou fázi se dosahuje zjednodušení separačního postupu (např. vynechání centrifugace) a snížení nespecifické vazby.

 

Synonyma:

Solid phase

 

Odkazy na jiné relevantní dokumenty:

Imunoanalýza fluorescenční kompetitivní

Imunoanalýza fluorescenční polarizační

Imunoanalýza luminiscenční kompetitivní

Imunoanalýza luminiscenční nekompetitivní

 

Metody separace na pevné fázi se výrazně rozšířily od 80. let zejména v souvislosti s používáním monoklonálních protilátek.

 

Materiály používané pro separaci na pevné fázi:

K dispozici je řada materiálů, ve formě mikročástic, zkumavek, mikrotitračních destiček, membrán.

§         Malé částice s velikostí pod 20 µm bývají z latexu, mikrokrystalické celulózy, porézního skla, lipozomů nebo magnetických částeček. Malé částice se obvykle přidávají do reakce ve formě supenze, pracuje se s nimi jako s nepravými roztoky. U separace se používá centrifugace.

§         Střední částice pod 1 mm bývají ze Sepharozy, Sephacrylu nebo Sephadexu D. Není nutno použít centrifugaci.

§         Velké částice nad 1 mm bývají z polystyrenu a Nylonu, Centrifugace není nutná.

§         Vlákna ze skla, nylonu, silikonové gumy. Nedá se s nimi zacházet jako s nepravými roztoky. Necentrifugují se.

§         Pevný povrch zkumavek, jamek v mikrotitračních destičkách apod.

 

Způsob vazby antigenu nebo protilátky na pevný povrch.

Na pevný povrch je možno navázat jak antigen, tak protilátku. Proteiny lze navázat na pevný povrch pasivní adsorpcí nebo pomocí kovalentní vazby. Pro malé hapteny je nutná nepřímá chemická konjugace prostřednictvím spojovacího můstku.

§         Adsorpce. Tento proces je závislý na pI proteinu a na povaze povrchu. Nevýhodou je relativní nestabilita této vazby. U kompetitivní reakce mohou být proteiny (antigen nebo protilátka) z povrchu vytěsněny jinými bílkovinami séra nebo smyty při promývacím procesu detergenty. Některé proteiny při vazbě na pevný povrch denaturují.

§         Kovalentní vazba. Tam, kde je to možné, se ji dává přednost před fyzikální sorpcí. Byla vypracována celá řada metod kovalentní vazby ligandů na pevnou fázi. Populární byla zejména metoda bromkyanidová (pracující ale s toxickou chemikálií), karbodiimidová, glutardialdehydová, hydrazidová nebo sukcinimidová.

 

Látky používané k zakotvení na pevný povrch.

Na pevný povrch může být vázán přímo ligand imunochemické reakce (antigen, protilátka) nebo jiná univerzální substance (druhá protilátka, Protein A apod.), která se využije pro imobilizaci specifické protilátky po proběhlé imunochemické reakci. Výhodou použití imobilizace univerzální substance je její použitelnost pro více metod a skutečnost, že průběh a rychlost imunochemické reakce nemusí být ovlivněna výrazně blízkosti pevné fáze..

Vazba ligandu imunochemické reakce.

Na pevnou fázi se podařilo zakotvit polyklonální antisérum, IgG globuliny, protilátky získané afinitní chromatografii, ascitickou tekutinu, fragmenty protilátek. V současné době jsou nejvíce imobilizovány monoklonální protilátky, i když imobilizace je provázena variabilitou imunochemické reakce. Monoklonální protilátky však lze získat v dostatečném množství a reprodukovatelným způsobem přípravy. Vazbou na pevnou fázi se prodlužuje stabilita protilátek

 

Univerzální vazebné reagenty.

Nepřímé vazebné techniky umožňují přípravu standardního povrchu, který může být využít pro různé druhy aplikací. Výhodou použití vazebných proteinů jako je bakteriální protein A nebo G zachycuje tu část protilátky (Fc fragment), která orientuje molekulu protilátky vhodnějším způsobem než přímé vazebné metody.

§         Protein A a G jsou bakteriální proteiny (Streptococcus a Staphylococcus) s vazebnou specifitou pro Fc fragment imunoglubulinu Protein A má relativní molekulovou hmotnost 42 000 Da má 6 nezávislých vazebných míst pro imunoglobuliny savčího původu. Protein A byl použit především pro purifikaci IgG a jako sekundární imobilizační reagencie pro primární protilátky různých druhů. Může být označen radiojodem, fluorescenční, luminiscenční sondou i enzymy. Protein G (povrchový protein Streptococcus G) váže rovněž Fc fragment imunoglobulinu podobným způsobem jako protein A, jeho vazebné charakteristiky se však poněkud liší. Jeho vyšší cena brání jeho širšímu použití v imunoanalýze.

§         Avidin –biotin Tento systém byl používán zejména v biologii a ve spojení s protilátkami je stejně intenzivně využíván. Avidin je tetramerický protein s identickými podjednotkami, každá z nich má molekulární hmotnost 15 000 Da. Je obsažen ve vaječném bílku a má extrémně vysokou afinitu k biotinu (ve vodě rozpustnému vitaminu B₆ ,10¹⁵ l/mol). Biotin je relativně polární látka a může být kovalentně navázána na protilátky za velmi mírných reakčních podmínek. Biotin a avidin jsou snadno komerčně dostupné za nízkou cenu. Nevýhodou tohoto systému je extrémně bazická struktura avidinu (pI=10,5), což vede k nespecifickým elektrostatickým silám.

§         Alternativou k avidinu je Streptavidin, protein izolovaný ze Streptomyceces cerevise. Streptavidin má nižší pI než avidin, vzhledem k tomu, že jeho 4 podjednotky obsahují mnohem méně bazických aminokyselin. Systém straptavidin-biotin našel široké použití v imunoanalytických aplikacích. Po reakci v kapalné fázi následuje rychlá separace pomocí univerzálního separačního systému.

 

Vlivy pevné fáze na imunochemickou reakci

Vazba protilátky na pevnou fázi omezuje pohyb molekuly protilátky a tím se zpomaluje kinetika imunochemické reakce, neboť rychlost reakce je závislá na difúzní charakteristice pohyblivé komponenty. Difúzní efekt pak závisí na geometrii povrchu pevné fáze. Geometrie je například určena poměrem velikosti částice a jejího povrchu. Difúzní efekty ovlivňují rychlost reakce v těch případech, kdy velikost částice přesahuje 40 µm, což je případ kuliček, pásků nebo zkumavek a mikrotitračních destiček s navázaným ligandem imunochemické reakce. Celková rychlost reakce je ovlivněna zejména koncentrací komponenty zakotvené na pevné fázi, čím je koncentrace protilátky nebo antigenu větší, tím větší je i rychlost reakce. Tu je možno zvýšit třepáním reakční směsi. Účinné je kontinuální třepání reakční směsi, nejúčinnější pak použití ultrazvuku, v případě použití magnetických částic lze použít i pulzního magnetického pole.

Významnou roli pro separaci volné a vázané frakce má promývání pevné fáze po odstranění reakční směsi. Jako promývací roztoky se většinou používají různé pufry s přídavkem solí, chaotropních látek, proteinů (hovězí sérový albumin), detergentů (Tween). Optimalizace promývacího procesu musí zajistit snížení vlivu biologické tekutiny (matrice vzorku) na nespecifickou vazbu, ale zároveň zabránit smývání ligandu zakotveného na pevné fázi. Způsob, jakým je promývací roztok aplikován, závisí na tom, jaká pevná fáze je použita. Promývání průtokem tekutiny může být použito u kuliček, mikrotitračních destiček či potažených zkumavek. Rychlost aplikace promývací tekutiny a rychlost jejího odstranění ovlivňuje jak nespecifickou vazbu, tak i smývání zakotveného ligandu. Promývací proces byl u řady systémů založených na využití pevné fáze automatizován, čímž byla zlepšena reprodukovatelnost promývacího procesu i omezení jeho vlivu na nespecifickou vazbu (IMx, AxSYM Abbott,, ACS:180 Ciba Corning, Immulite DPC atd).

 

Tabulka: Přehled možností přípravy pevné fáze.

 

Přímé imobilizační techniky
Reaktivní skupina pevného povrchu	Reaktivní skupina ligandu		Reagencie
COOH	NH2		Karbodiimid
NH2	NH2		Glutardialdehyd
OH	NH2		Bromkyan
CONH	NH2		Hydrazid
CONHHH2	CHO		Hydrazin
N-oxysikciimid	NH2		Sukcimimd
hydrazid	Karbohydrát		Jodistan
Nepřímé imobilizační techniky
Imobilizovaný reagent		Ligand
Protein A		Fc fragment IgG
Protein G		Fc fragment IgG
Streptavidin		Biotinilovaný antigen/protilátka
Anti-DNP protilátka		DNP konjugovaný Ag/protilátka
Anti-FITC protilátka		FITC-konjugovaný Ag/protilátka
Druhá protilátka (druhová)		Specifická protilátka

 

 

Literatura:

Price Ch.P., Newman D.J.: Principles and Practise of Immunoassay (Secomd edition), Macmillan Reference 1997, ISBN0-333-62504-8, Chapter 8, 155-168

 

 

Autorské poznámky:

Kristian Šafarčík