Stanovení sodného kationtu

Stanovení koncentrace sodného kationtu v biologických tekutinách je základním postupme pro hodnocení vodní a iontové rovnováhy.

 

V tomto dokumentu jsou akcentovány teoretické údaje. Údaje specificky popisující možnosti stanovení jsou v dokumentu Stanovení sodných iontů.

 

 

Biologická variabilita intraindividuální (%)	0,70
Biologická variabilita interindividuální (%)	1,00
Požadovaná nepřesnost (%)	0,40
Požadovaná bias (%)	0,30
Požadovaná celková chyba (%)	0,90
Kritická diference (požadovaná nepřesnost, intraindividuální variabilita, v %)	2,20

 

Preanalytické podmínky

Pokud se stanovuje v plazmě, je nutné použít přísadu heparinátu lithného nebo amonného. Pro stanovení v nekorpuskulární fázi plné krve je nutné použít titrovaný (balancovaný, iontově vyvážený) heparin. Pro odběr lze použít skleněné nebo plastové zkumavky, popřípadě skleněné kapiláry. Stabilita plné krve je při teplotě +4 až +25 °C 1 h. Po odstředění jsou sodné ionty v séru stabilní při +20 až  +25 °C 8 h, při +4 až +8 °C 2 týdny a při -20 °C 1 rok. Stabilita sodných iontů při stanovení v moči je 24 h při +4 až +8 °C. Stanovení může znehodnotit použití nevhodných zkumavek (obsahujících např. fluorid sodný nebo heparinát sodný) nebo nevhodných čistících prostředků (chlornan sodný, uhličitan sodný).

 

 

Metodiky stanovení

 

Potenciometrie (iontově selektivní elektrody, ISE)

Jako indikační se používá elektroda s iontově-výměnnou membránou, lze použít i skleněnou elektrodu; jako referenční elektroda se používá téměř výhradně Ag/AgCl elektroda, ojediněle i jiné, např. kalomelová elektroda. Napětí mezi indikační a referenční elektrodou se měří citlivým digitálním voltmetrem (změna aktivity o řád odpovídá změně potenciálu o 0,059 mV) s vysokým vstupním odporem (proto je během měření bezproudový stav).

ISE jsou konstruovány jako ponorné, průtokové nebo suché elektrodové systémy. Průtokový systém může používat buď okénko s indikační elektrodou (elektroda se snadněji vyměňuje, ale styková plocha elektrody a tím i její citlivost je menší) nebo indikační elektrodu ve formě trubky (výměna elektrody je o něco složitější, ale styková plocha se vzorkem a tím i citlivost měření je větší). Schéma ukazuje obě možnosti použití průtokového systému. Vedle potenciálu indikační a referenční elektrody se uplatňuje ještě difusní potenciál E_d.Příklady použitých ionoforů v iontově-výměnné elektrodě jsou ETH 227 (N,N',N''-triheptyl-N,N',N''-trimetyl-4,4',4''-propylidintris(3-oxabutyramide), ETH 157 N,N'-dibenzyl-N,N'-difenyl-1,2-fenylendioxodiacetamid), ETH 2120 (N,N,N',N'-tetracyclohexyl-1,2-fenylendioxodiacetamid), makrocyklické crown-etery oblíbené u japonských výrobců jako DD-16-C-5, 2,3:11,12-didekalino-16-crown-5 a dále je možné zmínit decylmonensin, 2-nitrofenyloktyleter nebo tetrafenylborát sodný. Pro přípravu mikroelektrod k měření sodných iontů se používá směs několika (obvykle tří) ionoforů, označovaná jako koktail. Přestože je mez detekce sodných elektrod s kapalnou membránou asi 1000-krát vyšší než u skleněné elektrody, používají se v současných analyzátorech prakticky výhradně indikační elektrody s kapalnou membránou, které jsou schopné sledovat aktivity sodných iontů od 1 mmol/l. Skleněné elektrody totiž nelze konstruovat tak malé jako elektrody s kapalnou membránou a bylo nutné poskytnout alespoň 100 µl materiálu k měření. Obvyklé složení měrného skla skleněné elektrody je 11 % Na₂O, 18 % Al₂O₃ a 71 % SiO₂. Měřený potenciál iontově selektivní elektrody E určuje Nernstova rovnice:

,

kde E₀ je standardní potenciál (potenciál, který by elektroda měla při jednotkovém poměru aktivit komponent účastnících se elektrodového děje), R je plynová konstanta, T je teplota (termodynamická, vyjádřená v °K), z je náboj měřeného iontu, F je Faradayova konstanta, γ je molální aktivitní koeficient a c_i je koncentrace iontu. Vzhledem k tomu, že ve vztahu je celá řada konstant, je možné ho zjednodušit a vyjádřit jako aktivitu a_i. V biologických materiálech se kromě měřeného iontu vyskytují i další (potenciálně interferující) ionty a proto je správnější vyjadřovat měřený potenciál pomocí Nikolského-Eisenmanovy rovnice:

,

kde K je standardní poteciál iontově-selektivní elektrody (závisí na druhu vnitřní srovnávací elektrody, teplotě a Donnanově potenciálu; Donnanův potenciál je takový membránový potenciál, kdy je membrána zcela neprostupná alespoň pro jednu složku roztoku), n_s je náboj sledovaného iontu a a_s jeho aktivita, n_i je náboj interferujícího iontu a a_i jeho aktivita, K_i je konstanta selektivity vyjadřující poměr koncentrace sledovaného iontu a maximálně přípustné koncentrace interferujícího iontu.

Měření probíhá v neředěných vzorcích (přímá metoda ISE, direct ISE) nebo v ředěných vzorcích (nepřímá metoda ISE, indirect ISE). Přímá metoda umožňuje měřit aktivitu sodných iontů v plné krvi, případně v plazmě nebo séru. Elektrochemické analyzátory používané v POCT měří výhradně v plné krvi, protože tento postup umožňuje za 1 – 2 min získat výsledek. Automatické analyzátory v laboratořích také používají přímé měření, ale v plazmě nebo séru. Technické uspořádání elektrochemického modulu vždy umožňuje paralelní měření sodných i draselných iontů a většinou také chloridů. Miniaturizace ISE umožnila mnohem vyšší využívání přímých metod měření. Tato metoda poskytuje správné výsledky i v případě tzv.pseudohyponatremie, kdy se v důsledku vysoké koncentrace lipidů (vyjímečně i bílkovin) významně snižuje podíl vody v plazmě (ionty jsou vysoce polární a tedy rozpustné jen ve vodě !). Protože aktivitu měříme přímou  metodou jen ve vodném podílu, není zastoupení iontů změnou velikosti vodného podílu ovlivněno. Pokud uvažujeme celkovou koncentraci včetně nevodného podílu budou výsledky falešně  nízké (odtud název pseudohyponatremie) a neodpovídají hladině iontů ve vodní frakci. Koncentrace sodných iontů ve vodném podílu je pochopitelně vyšší než celková koncentrace (např. 158 mmol/l ve vodném podílu odpovídá 145 mmol/l celkové koncentrace). Naproti tomu aktivita je podstatně nižší, protože aktivitní koeficient je přibližně 0,7. Software analyzátoru musí tedy změřenou aktivitu (např. 158 x 0,7 = 110,6) přepočítat na celkovou koncentraci (např. 145 mmol/l), tak aby byly výsledky kompatibilní s historicky povědomou plamenovou emisní fotometrii. Lineární odezva sodné elektrody je v intervalu 1 – 100 mmol/l (kapalná membrána), resp. 0,001 – 100 mmol/l (skleněná membrána). Při stanovení sodných iontů v moči se musí vzorky vždy ředit diluentem s velkou iontovou silou, aby se kompenzoval vliv kolísání iontové síly ve vzorku moče. Koncentrace sodných iontů v moči se mění i dvacetinásobně a iontově selektivní elektroda není schopna pracovat v takovém rozsahu změny iontové síly. Proto se přidává diluent obsahující konstantní množství disociované a dobře rozpustné soli (např. desetinásobné ředění diluentem obsahujícím > 100 mmol/l fosforečnanu hořečnatého) a kolísání  koncentrace iontů v moči pak výslednou iontovou sílu ovlivňuje málo. Nicméně spolehlivé měření v moči závisí i na dalších faktorech, např. povrchovém napětí. Proto je nutné vždy používat diluent doporučený výrobcem elektrochemického modulu. Elektrody jsou vyhřívány na 37 °C.

Existuje možnost stanovení koncentrace na pevné fázi, principem je rovněž potenciometrie. V tomto případě se speciální multipipetou se dvěma špičkami dávku paralelně vzorek i referenční kapalina. Potenciometrická destička sestává s pěti vrstev. Nahoře je papírový můstek, který spojuje obě části komůrky a také plní funkci izolátoru proudu. Pod ním je vrstva polymeru, která slouží jako iontově selektivní membrána. Dalšími vrstvami jsou referenční vrstva želatiny s krystaly chloridu sodného a Ag/AgCl vrstva, kde dochází ke vzniku potenciálu. Spodní vrstva má funkci nosiče.

 

 

 

 

 

Plamenová emisní spektrofotometrie (PES)

Měření při 589 nm v plameni propan-vzduch (1925 °C) v roztoku zředěném lithiovou solí, která slouží jako tzv. vnitřní standard (sledovaný při 671 nm) k vyrovnání měřeného signálu. Tím se odstraní kolísání naměřených hodnot vlivem tlaku plynu a viskozity roztoku. Do bezbarvého plamene se vhání roztok ve formě mlhy (aerosolu) a plamenem excitované atomy (resp. jejich elektrony) při návratu na základní energetickou hladinu poskytují záření, které je rozloženo jednoduchým disperzním systémem a měřeno fotoelektrickým článkem. Atomizér sestává z trysky rozprašující vzorek, ze směšovače aerosolu s palivem a z hořáku. Při rozprášení vzorku do plamene dochází k odpaření vody, část molekul je disociována a volné atomy jsou zčásti ionizovány odštěpením elektronů. Elektrony v excitovaném stavu dosahují vyšší orbitaly a při návratu do základního stavu vyzařují záření, jehož intenzita je dle Lomakina:

I = a.c^b,

kde a je konstanta, c je koncentrace a b je koeficient reabsorpce záření. Plamenový fotometr je vybaven automatickou potenciometrickou kompenzací na vnitřní standard (mimo chlorid lithný lze použít i chlorid cesný a sledovat emisní čáry cesia 455,5 resp. 852,1 nm). Plamenové fotometrie je spolehlivá a levná metoda, která je pokládána za referenční pro stanovení koncentrace sodných (i draselných) iontů. V laboratorní praxi je opouštěna, neboť plamenové fotometry se poměrně obtížně (na rozdíl od ISE modulů) integrovaly do automatických analyzátorů. Vývoj v této oblasti je uzavřen a plamenové fotometry se přestaly vyrábět. Nicméně i u plamenové fotometrie se objevovala řada interferencí jako absorpce emitovaných elektronů ze středu plamene v jeho okrajových chladnějších částech (tzv. samozvrat), vzájemné ovlivnění dvou prvků jejichž emisní čáry jsou blízké, interference kationtů (v horkém plameni podle zákona o působení hmoty ionizace jednoho prvku a zvýšený počet volných elektronů snižovaly ionizaci prvku jiného) a rozprašovací interference (rozdílné povrchové napětí standardu a vzorku – odstraňuje se přídavkem detergentu do ředícího roztoku). 

 

Spektrofotometrie

β-galaktozidáza je aktivována sodnými ionty při hydrolýze o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosidu; vzniká galaktóza a o-nitrofenol (chromofor), jehož vznik se měří kineticky při 420 nm. Ke snížení jinak vysoké koncentrace sodných iontů při této katalytické reakci se používá Kryptofix 221 (4,7,13,16,21-pentaoxa-1,10-diazabicyklo[8,8,5]trikosan). Jiný postup využívá také kryptandy (makrocyklické ionofory, které mají v sobě prostor do kterého se přesně vejde stanovovaný ion, např. sodný v případě trinitroanilinkryptahemi-sferandu). Vazba do dutiny  makrocyklického ionoforu v některých případech vyvolává spektrální posun, takže můžeme sledovat velikost  nárůstu absorbance, která odpovídá koncentraci sodných iontů. Obě spektrofotometrické analýzy jsou drahé ve srovnání s ISE metodou a používají se jen vyjímečně.

 

Fluorimetrie

Využívá se změny fluorescence barviva (nilská modř) na povrchu optického vlákna (optoda) podle koncentrace sodného iontu. Sodný ion je vychytávaný vysoce lipofilním neutrálním ionoforem ETH 4120, který je selektivní vůči sodným iontům. Postup je použitelný u analyzátorů POCT v záchranné službě.

 

Atomová absorpční spektrofotometrie(AAS)

Měření koncentrace sodíku se touto metodou v klinické biochemii neprovádí i když je technika měření při 589 nm a příslušná dutá katodová lampa běžně komerčně dostupná. Hlavní důvod tkví ve velkém počtu požadavků na vyšetření sodných iontů, poměrně pomalé technice AAS a nutnosti oddělení části vzorku z hlavního analytického proudu v analyzátoru pro analýzu AAS.

 

Definitivní metoda

Tato metoda pro stanovení sodných iontů (od roku 1996) vychází z iontově výměnného principu. Sodné ionty se vychytají na pryskyřici, eluují, převedou se na síran sodný a stanoví se gravimetricky. Nejistota při použití referenčního materiálu je pod 1 %.

 

Interpretační poznámky se vztahem k analytice

Plamenová emisní spektrofotometrie měří koncentraci sodného kationtu v celém objemu vzorku; při vysokém obsahu proteinů a lipidů dochází k tzv. pseudohyponatrémii. To byl hlavní důvod opuštění této metody, protože tato chyba měření se projevuje zejména u těžce nemocných pacientů. Při přímém měření ISE (bez ředění) není postižen podíl sodného kationtu vázaného na hydrogenkarbonátový anion, na proteiny a na další anionty. Výhodou je nezávislost na koncentraci proteinů a lipidů a měření aktivity ve vodní fázi vzorku (v podstatě jako v případě osmolality v mmol/kg vody, byť se udává v mmol/l), která má podstatně vyšší biologický význam. Při nepřímém měření ISE ve zředěných vzorcích se eliminuje vliv vazby sodného kationtu, takže v podstatě odpovídá měření koncentrace plamenovou emisní spektrofotometrií. Výsledky přímého (aktivita) a nepřímého ("koncentrace") potenciometrického měření nelze vzájemně zaměňovat. Nedostatek selektivity iontově selektivních elektrod může být způsobený usazováním bílkovin na membráně indikační elektrody nebo kontaminací membrány ionty, které mění odezvu membrány tak, že buď konkurují stanovovaným iontům nebo s nimi reagují.

 

Další informace

Postupy pro hodnocení vnitřního prostředí

 

Petr Štern (2008-07-09)