Stanovení koncentrace vápenatého kationtu je základním postupem pro hodnocení vnitřního prostředí především v souvislosti s nervosvalovou dráždivostí a posuzováním funkčních změn metabolismu skeletu.

Synonyma

vápník celkový, kalcium, calcium, Ca

Ukazatele související s biologickou variabilitou

Biologická variabilita intraindividuální (%)	1,90
Biologická variabilita interindividuální (%)	2,80
Požadovaná nepřesnost (%)	1,00
Požadovaná bias (%)	0,80
Požadovaná celková chyba (%)	2,40
Kritická diference (požadovaná nepřesnost, intraindividuální variabilita, v %)	6,00

Preanalytické podmínky

Pro stanovení v nekorpuskulární fázi plné krve a v plazmě je nutné použít titrovaný (balancovaný, iontově vyvážený) heparin; použití heparinátu lithného nebo sodného pro stanovení v plazmě je méně vhodné. Jakákoli kontaminace vzorku chelátem (např. EDTA používané pro vyšetření krevního obrazu), oxalátem, citrátem nebo fluoridem sodným vede ke sníženým hodnotám kalcia v séru (plazmě). Pro stanovení ionizované frakce pomocí ISE je vhodný anaerobní odběr, současné měření pH vzorku a adjustace výsledku na pH 7,40. Při odběru je nutné zabránit venostáze (nadměrné zatažení manžetou může způsobit zvýšení vápníku 0,12 až 0,25 mmol/l v důsledku vytlačení vody z cévního kompartmentu). Separaci plazmy je třeba provést urychleně (kontakt s krevními elementy snižuje kalcium v plazmě). Odběrové zkumavky mohou být plastové nebo skleněné. Vápník v plazmě nebo séru je stabilní při +20 až +25 °C 8 h (uvádí se až 7 dní), při +4 až +8 °C 24 h(až 3 týdny), při -20 °C 32 týdny. Pro stanovení v moči je nutná acidifikace na pH 1,0 - 2,0 pomocí 6 mol/l HCl, aby se uvolnilo kalcium z vazby. V případě sbírané moče je vhodné současně stanovit kreatinin pro posouzení správnosti sběru. Stabilita po okyselení v plastové lahvi bez konzervačních přísad je při +20 až +25 °C 2 dny, +4 až +8 °C 24 h (4 dny), -20 °C 3 týdny. 5 % populace má hyperkalcurii.

Pro výpočet frakční exkrece je nutné využít ionizované kalcium v séru nebo plazmě. plazmě (stabilita +4 až +8 °C 2 h). Vhodná je naměřená hodnota pro ionizované kalcium (iCa); vypočítaná hodnota iCa z celkového vápníku a bílkoviny je orientační a u pacientů s velkými odchylkami pH a bílkoviny od normálu může být zavádějící. Cvičení paží před odběrem vytváří laktát, snižuje pH a tím zvyšuje iCa.

Metodiky stanovení

Spektrofotometrie

Nejvíce se využívá principu tvorby o-kresolftalein komplexonu (na obrázku) s absorbancí při 546 - 590 nm (obvykle 570 – 580 nm), kdy v alkalickém prostředí (pH 10,8) vzniká ftaleinový purpur (pufr glycin, monoetanolamin, 2-amino-2-metyl-1-propanol, nebo dietanolamin).

Interference hořečnatých iontů se odstraňuje pomocí 8-hydroxychinolinu. Reakce je nelineární a při nižších koncentracích vápníku vzniká adukt s jedním atomem vápníku vykazující nižší absorbanci, zatímco při vyšších koncentracích vzniká adukt se dvěma atomy vápníku, který absorbuje v měřené oblasti více. Linearitu reakce lze zlepšit přidáním octanu sodného. Stabilitu reakčního aduktu zvyšují kyanidy (KCN). Zákal lipidů lze snížit přídavkem močoviny, která současně podporuje vznik aduktu. Linearita: do 5,0 mmol/l v séru a 10 mmol/l v moči. Mez detekce (3 SD pro blank stanovený 20x): sérum ±0,01 mmol/l, moč ±0,03 mmol/l. Preciznost v sérii (CV): sérum 0,48 – 0,57 %, moč 1,00 – 2,05 %; celkem: sérum 0,94 – 0,96 %, moč 1,21 – 2,60 %. Stanovení ovlivňuje lipémie (Intralipid 10g/l < 10%) a faktory ovlivňující vznik vápenatých komplexů a sloučenin jako jsou citrát, oxalát, EDTA. Stanovení vápníku neruší hemoglobin do koncentrace 2,0 g/l a interferuje < 3% při 5 g/l. Kromě lipidů a hemoglobinu interferují myelomové bílkoviny. Bilirubin v koncentraci 684 µmol/l interferuje < 3%. Magnézium v koncentraci 4 mmol/l interferuje < 10% v séru a < 3% v moči. Askorbát 2,84 mmol/l v moči interferuje < 3%. Metodu nelze použít do 24 h u pacientů, jimž bylo podáno gadolinium jako kontrastní médium.

Další spektrofotometrické metoda je dražší, ale poskytuje analyticky spolehlivější výsledky. Organické činidlo arsenazo III (na obrázku) má v slabě kyselém prostředí imidazolového pufru (pH 6) k vápenatým iontům mnohem vyšší afinitu než k iontům hořečnatým (není třeba maskovat Mg²⁺).

Vznikající modrý adukt je stabilní a lze jej měřit při 650 - 680 nm (antikoagulans citrát způsobuje negativní interferenci), kde neruší biologické pigmenty. Nicméně intenzita absorpce je závislá na koncentraci sodných iontů a proto musí být zajištěno, aby kolísání koncentrace sodných iontů v nativních vzorcích reakci neovlivnilo. K potlačení interference bílkovinné matrice (zákal) se přidávají detergenty. Tento postup lze použít i v postupu suché chemie s následnou detekcí reflexní fotometií. Linearita: 0,50 – 6,00 mmol/l. Mez detekce je 0,125 mmol/l, mez stanovitelnosti 0,25 mmol/l. Preciznost pro sérum dosáhla v sérii CV 0,5 – 0,6 %, celkem 1,0 – 1,2 %; pro moč v sérii 0,5 – 0,6 %, celkem 0,7 %.Další barevné reakce poskytují: glyoxal-bis(2-hydroxyanil), alizarin, chlorfosfonazo III a metyltymolová modř.

Fluorimetrie: Titrace vápenatých iontů EDTA nebo EGTA (etylenglykoltetraoctová kyselina) v alkalickém prostředí, kdy Ca²⁺ vytěsňuje z chelátu fluorescenční indikátor (kalcein) je citlivá metoda. Volný indikátor při ozáření světlem 490 (405) nm fluoreskuje a emituje světlo 520 (485) nm, které se měří fluorimetrem. Rozsah měření 1,25 – 3,75 mmol/l. Přesnost ±0,05 mmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 1,2 %, mezi dny 2,7 %. Výtěžnost byla 98 – 101 %.

Atomová absorpční spektrofotomerie (AAS)

Měření se provádí při 422,7 nm v plameni acetylén-vzduch (kolem 2300 °C). Jako vnitřní standard se používá chlorid lanthanitý (strontnatý). Protože fosforečnany a sírany vápenaté jsou tepelně stabilní, je nutné uvolnit kalcium z této vazby přidáním chloridu lanthanitého do analyzovaného vzorku. Interferenci proteinů (rozdílná viskozita sér) lze odstranit dilucí vzorku zředěnou kyselinou chlorovodíkovou.

Princip atomové absorpční spektrofotometrie (AAS)

Hořák s laminárním průtokem u AAS

Nepatrné interference sodných, draselných a hořečnatých iontů lze zcela eliminovat používáním kalibrátorů, obsahujících fyziologickou koncentraci uvedených kationtů. U dvoupaprskového AAS lze použít stroncium jako vnitřní standard. AAS je referenční metodou pro stanovení kalcia. AAS je optická metoda, která je založena na Kirchhoffově zákonu: Volné atomy absorbují výhradně záření takových vlnových délek, které mohou samy vyzařovat. Při srážce fotonu s volným atomem dochází k pohlcení energie a přechodu valenčních elektronů ze základního orbitalu na orbital s vyšší energií, tedy excitaci atomu (rezonanční přechod). V rezonančním přechodu je velmi úzký frekvenční rozsah emise i absorpce. Absorpční spektrum atomů v plynném stavu je čárové, má šířku 0,001 – 0,01 nm. Mezi počtem atomů a absorbancí platí vztah daný Lambert-Beerovým zákonem. Excitované atomy při návratu do základního stavu emitují světlo stejných vlnových délek. V AAS není v plameni excitována iontová forma prvku, ale dochází k jeho disociaci z chemických vazeb a k vazbě elektronů uvolňovaných v procesu hoření. Atomy se poté dostávají do základního stavu a prvek v této formě absorbuje svou specifickou vlnovou délku. Základní části měřícího přístroje jsou zdroj primárního záření (obvykle dutá katoda s příměsí stanovovaného prvku), absorpční komora, monochromátor (rovinná mřížka) a detektor (fotonásobič). Stanovení vápníku se provádí nejvíce plamenovou AAS s hořákem s laminárním prouděním. Vzorek je rozprašován do komůrky (účinnost 10 – 15 %) a proudí s palivem do laminárního plamene. Zde se rozpouštědlo odpařuje a dochází k atomizaci (Bezplamenová verze AAS využívá elektrotermické atomizace v grafitové peci; tento postup je citlivější, dražší a pomalejší - používá se ke stanovení stopových prvků). Preciznost dosahuje v sérii CV 2 – 3 %, přesnost ±1,7 až ±3,3 %, výtěžnost 99 %.

Definitivní metoda pro stanovení vápníku je izotopová diluce spojená s detekcí hmotnostní spektrometrií (od r. 1972). Je založena na definovaném přídavku izotopu ⁴⁴Ca k přirozenému izotopu ⁴⁰Ca a měření poměru izotopů ⁴⁰Ca/⁴⁴Ca hmotnostním spektrometrem. Postup dosahuje přesnost ±0,1 až ±0,25 %. I když metoda dosahuje preciznost CV 0,21 %, vlivem chyby dávkovačů je preciznost CV 1,12 %.

Plamenová emisní spektrofotometrie

Měření se provádí při 622 nm v plameni acetylén-vzduch. Analytické znaky metody jsou jen o málo horší než u AAS. Tyto přístroje měří současně koncentraci sodných iontů a provádějí automatickou kompenzaci interference vysoce zářivého plamene sodíku (589 nm). Doporučuje se také přidávat EDTA, která vytvoří s vápenatými ionty silný chelát (snadno spalitelný) a tím uvolní Ca²⁺ z tepelně stabilních fosfátů. Podrobný popis této dnes již historické techniky je uveden u stanovení sodných iontů. Preciznost dosahuje v sérii CV 2,9 – 3,6 %.

Titrační metody

Mají pouze historický význam. Používaly se chelatometrické titrace komplexonem II EDTA) nebo III (dvojsodná sůl EDTA) na metalochromní indikátory: murexid, eriochromovou čerň T, chloranilát nebo pyrokatechonovou violeť s následnou fotometrickou detekcí. Citlivější je titrace vápenatých iontů EDTA nebo EGTA (etylenglykoltetraoctová kyselina) v alkalickém prostředí, kdy Ca²⁺ vytěsňuje z chelátu fluorescenční indikátor; volný indikátor při ozáření světlem 490 nm fluoreskuje a emituje světlo 520 nm, které se měří fluorimetrem.

Iontově selektivní elektrody uvádíme nakonec z didaktických důvodů. Tento potenciometrický postup umožňuje měřit aktivitu vápenatých iontů (s jedinou výjimkou, kdy analyzátor Nova 8 firmy Nova Biomedical měřil také celkový vápník). Diagnostický význam tohoto stanovení je značný, nicméně současné iontově selektivní analyzátory měří pouze ionizovaný vápník a proto byl tento postup zařazen až nakonec. Pro stanovení aktivity iCa se používají elektrody ionexového typu, nebo elektrody s neutrální membránou. Oba typy mají kapalnou membránu, obsahující organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou, ve kterém jsou rozpuštěny látky schopné vyměňovat nebo zachycovat ionty z vnějšího roztoku. Hydrofobní přepážka (obvykle z PVC) odděluje kapalnou membránu od měřeného roztoku. Elektrody ionexového typu používají ionex didecylfosforečnan vápenatý [C₁₀H₂₁O)₂PO₂]₂Ca v dekan-1-olu nebo dioktylfenylfosfonátu (obrázek). Na fázovém rozhraní s měřeným roztokem se ustavuje rovnováha ovlivněná koncentrací vápenatých iontů v tomto roztoku.

Dioktylfenylfosfát

Elektrody s neutrální membránou zachycují vápenaté ionty do dutin, které jim vyhovují svou velikostí (jedná se o syntetické cyklické polyetery, např. ETH 1001 (obrázek) t.j. N,N´-bis[11-(etoxykarbonyl)undecyl]-N,N´-4,5-tetrametyl-3,6-dioxaoktandiamid, nebo přírodní makrocyklické sloučeniny). Polymerní membrána obsahuje rozpouštědlo s takovými nosiči.

ETH 1001

Při měření ionizovaného vápníku měříme potenciál měrné elektrody vůči referenční Ag/AgCl elektrodě. Obě elektrody jsou spojeny můstkem s nasyceným roztokem KCl. Tím je zaručeno jeho konstantní složení a současně nulový difuzní potenciál (iontová pohyblivost draselných a chloridových iontů je shodná). Obvyklé jsou ještě dvě přídavné platinové elektrody, které slouží pro detekci kapaliny nebo vzduchu při automatizovaném postupu. Předpokladem spolehlivosti měření je minimální odchylka mezi aktivitou vápenatého kationtu ve vzorku a v kalibračním roztoku. Expozice vzorku na vzduchu vede k úniku CO₂ a změně pH na kterém je hodnota iCa závislá. Proto je nutný anaerobní odběr, zpracování i měření. Analyzátory jsou vybaveny pH elektrodou a kromě aktuální hodnoty iCa uvádějí i hodnotu korigovanou na pH 7,4. Ventilace pacienta může ovlivnit výsledek. Vliv teploty není podstatný v intervalu měření ±2 °C. Abnormální koncentrace nebo složení albuminu může u některých přístrojů zapříčinit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. Pro měření je vhodnější sérum než plazma (vliv heparinu), ale jeho anaerobní získání může být problémem. Sraženinu je nutné rychle separovat a vzorek neskladovat (vliv pH); iCa elektroda je citlivá na iontovou sílu a při měření interferují sodné ionty. Proto má každý solidní přístroj ke stanovení aktivity iCa také sodnou elektrodu. Aktivita sodných iontů nemusí být pro obsluhu dostupná, ale přístroj ji měří a používá ke korekci naměřených hodnot aktivity iCa. Vzhledem k velkému kolísání iontové síly v moči se aktivita iCa v moči nestanovuje. Mimo to iCa elektroda nepracuje při pH < 5,5, které se v moči může vyskytnout. Falešnou pozitivitu mohou způsobit bromidy.

Pro úplnost uvádíme ještě historickou možnost stanovení celkového vápníku ISE. Kromě výše uvedených elektrod (měrné, referenční, pH a sodné) obsahoval analyzátor ještě další iCa elektrodu, která měřila v poměrně velmi agresivním prostředí roztoku obsahujícího HCOOH, HCOONa, NH₄Cl, ClCH₂COONa – kde byl všechen vápník v roztoku převeden na Ca²⁺. Tento přístroj (Nova 8) dosahoval velmi dobré korelace s výsledky AAS (referenční metoda) a umožňoval dokonce stanovit celkový vápník v moči po okyselení HCl na pH 1 a přidání tris(hydroxymetyl)aminometanového pufru.

Podle údajů College of American Pathologists z roku 2001 používalo 45 % účastníků o-kresolftaleinovou metodu a 39 % arsenazo III.

Referenční materiálem je uhličitan vápenatý NIST pod označením SRM 915.

Toleranční limit EHK: sérum a plazma 10 %, moč 18 %.

Interpretační poznámky se vztahem k analytice

Pro odhad koncentrace ionizovaného kalcia existují výpočty z koncentrace celkového kalcia, albuminu (proteinů) a případně pH. Výpočet je orientační a vychází z rovnic, které vykazují pravděpodobnostní charakter. Silná hemolýza zapříčiní falešně vysoké výsledky. U pacientek, které berou hormonální kontraceptiva je kalcium v moči sníženo.

Interference

Koncentraci vápníku v séru a plazmě snižují: aldakton, alkohol, bilirubin (342 µmol/l), citronan, EDTA, erythropoietin, etylenglykol, fenobarbital, fluoridy, fytáty, hemolýza (fluorescenční metody), gasterin, gastrin, glukagon, lipémie (o-kresolftaleinkomplexon), otruby, prokain penicilin G, peritoneální dialýza, poloha vleže, rhytmochin II, sodanton, spasmoveralgin, šťavelan, těhotenství, aj.

Koncentraci vápníku v séru a plazmě zvyšují: B-komplex, furanthril, furantral, furosemid, glukonát vápenatý, hemodialýza, hemolýza (silná), hydrochlorothiazid, klid na lůžku, kofein, laktace, manit, menopauza, stáří, superanabolon, transplantace ledvin, zatažení paže při odběru, aj.

Koncentraci vápníku v moči snižují: citronan, fytáty, hormonální kontraceptiva, obezita, šťavelan, trimecryton, urandil, aj.

Koncentraci vápníku v moči zvyšují: aldakton, alkohol, amiklaran, aqua carminativa, B-komplex, čokoláda, dexamethason, edecrin, ILGF-I, kofein, menopauza, nutramin, sacharóza, sírany, těhotenství, vespiron, aj.

Další informace

Postupy pro hodnocení vnitřního prostředí

Petr Štern (2011-03-03)

Stanovení vápenatého kationtu