Stanovení fosfátového aniontu

Synonyma

fosforečnany anorganické

Starší název anorganický fosfor je vlastně nonsens, protože nestanovujeme tento nekov, ale směs hydrogenfosfátů a dihydrogenfosfátů. Vedle názvů hydrogenfosforečnan a dihydrogenfosforečnan se méně často používá hydrofosforečnan a dihydrofosforečnan (poslední dvojice je ale uvedena v ČSN).

Preanalytická fáze

Pro stanovení v plazmě je možné použít heparin lithný nebo sodný. Oxalát, citrát nebo EDTA se nesmí použít jako antikoagulancia. Fosfáty vykazují významný denní rytmus, doporučená doba odběru na stanovení v séru nebo plazmě je ráno nalačno. Hodnoty anorganických fosfátů v séru jsou nejvyšší u novorozenců a s věkem se snižují.

Po odběru krve do skleněné nebo plastové zkumavky je nutná bezprostřední separace korpuskulární fáze, jinak jsou výsledky falešně vyšší. Stabilita je pak 4 dny při +20 až + 25 °C, 7 dnů při +4 až +8 °C a 1 rok při -20 °C, -70 °C 5 let. Pro stanovení v moči je nutná acidifikace na pH 1,0 - 2,0 pomocí 6 mol/l HCl, aby nedošlo k vysrážení fosforečnanů. Stabilita acidifikovaných vzorků je 2 dny při +20 až +25 °C, 3 dny při +4 až + 8 °C a 12 týdnů při -20 °C.

Silná hemolýza při stanovení ruší.

Poznámky k analytické metodě

Spektrofotometrie: využívá se řady postupů, ale metody lze rozdělit do čtyř skupin: vznik molybdátofosforečné kyseliny (přímo, nebo po redukci na molybdenovou modř), vznik kyseliny vanadátomolybdátofosforečné, tvorba komplexu kyseliny molybdátofosforečné s bazickými barvivy, např. rodaminem B a konečně enzymové reakce.

Stanovení vyžadující deproteinaci vzorku (např. kyselinou trichloroctovou v prostředí 1 mol/l H₂SO₄ nebo HNO₃) jsou opuštěny v praxi klinické biochemie. Základem současných metod je Fiske-Subarrowův postup, kdy fosfáty reagují s molybdenanem amonným za tvorby fosfomolybdenanu amonného. Vzniklý komplex se může měřit přímo při 340 nm, nebo po redukci na molybdenovou modř při 600 – 700 nm. Jako redukovadla lze použít SnCl₂ samotný nebo v kombinaci s hydrazinem, dále hydrochinon, fenylhydrazin, p-semidin (N-fenyl-p-fenylendiamin), FeSO₄, kyselinu askorbovou, metyl-4-aminofenylsulfát, aminonaftylsulfonovou kyselinu (nevýhoda – snadno precipituje) a další. FeSO₄ a kyselina askorbová jsou jemná redukovadla, která neštěpí vazby organických fosfátů. Přímé měření při 340 nm je rychlejší a jednodušší. Při dodržování pH reakce je výsledná absorbance stabilní. Při snížení kyselosti může docházet ke spontánní redukci. Nevýhodou jsou větší interference při ikteru, lipémii a hemolýze. Vznik molybdenové modře se používá také k detekci fosforečnanů na filmech se suchými reagenciemi pomocí reflexní fotometrie.

Další typ reakcí fosforečnanů probíhá v kyselém prostředí s molybdenanem amonným a vanadičnanem amonným za vzniku žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné s absorpčním maximem 380 – 410 nm. Reakce může poskytovat falešně vyšší výsledky v důsledku potenciální hydrolýzy organických fosfátů.

Postup s tvorbou komplexu molybdátofosforečné kyseliny s bazickými barvivy se v našich laboratořích také používá. Fotometrická detekce komplexu s malachitovou zelení (více využívaná než rodamin B) se provádí při 640 nm.

Enzymových stanovení je celá řada i když vzhledem k vyšší ceně analýzy se v laboratořích nepoužívají. Jeden postup je založen na principu tvorby hypoxantinu z inosinu a fosfátu za katalýzy purinnukleosidfosforylázou. V dalším kroku je hypoxantin oxidován xantinoxidázou na kyselinu močovou a vznikající peroxid vodíku mění chromogenní substrát N-etyl-N-(3-metylfenyl)-N-acetyletylendiamin na purpurový komplex měřený při 555 nm.

Jiný postup využívá enzymové kaskády glykogenfosforylázy, fosfoglukomutázy a glukóza-6-fosfátdehydrogenázy v přítomnosti glykogenu. S prvním enzymem se glykogen fosforyluje fosfáty ze vzorku na α-D-glukóza-1-fosfát, který se s druhým enzymem izomeruje na α-D-glukóza-6-fosfát a následuje redox reakce katalyzovaná třetím enzymem, kdy oxidací vzniká 6-fosfo-D-glukonát a současně se redukuje NADP⁺ na NADPH.

Kinetické měření při 340 nm lze použít i v levnější verzi enzymových reakcí, kdy se za katalýzy sacharózafosforylázou v prvním kroku fosforyluje sacharóza fosfáty ze vzorku na α‑D-glukóza-1-fosfát (při štěpení vzniká D-fruktóza). Následně se uplatní fosfoglukomutáza, která jej izomeruje na α-D-glukóza-6-fosfát. Posledním krokem je redox reakce katalyzovaná glukóza-6-fosfátdehydrogenázou, kdy oxidací vzniká 6-fosfo-D-glukonát a současně se redukuje NAD⁺ na NADH.

Izotachoforéza: využívá dělení iontů ve stejnosměrném elektrickém poli na základě rozdílných pohyblivostí. Tímto postupem lze kvantifikovat zvlášť ionty HPO₄^2- a H₂PO₄^-. Metoda se používá při základním a aplikovaném výzkumu.

Gravimetrie: je referenční metodou stanovení celkového fosforu (tedy i organického). Po mineralizaci kyselinou sírovou a dusičnou se fosfor vysráží jako chinolinfosfomolybdenát, vysuší a precipitát se stanoví gravimetricky.

Definitivní metoda stanovení anorganických fosfátů nebyla navržena, protože ID-MS postup má značné vychýlení. To je do značné míry způsobeno nejednoznačnou definicí anorganických fosfátů.

Biologická variabilita intraindividuální / interindividuální: 8,50 % / 9,40 %

Požadovaná preciznost / vychýlení: 4,30 % / 3,20 %

Požadovaná celková chyba: 10,20 %

Kritická diference (požadovaná nepřesnost, intraindividuální variabilita): 26,4 %

Toleranční limit EHK: sérum a plazma 15 %, moč 18 %.

Interference

Koncentraci fosfátů v séru snižují: acetazolamid, adrenalin, albuterol, alendronát, aqua carminativa, arginin, ATP, azathioprin, bilirubin (> 50 µmol/l), citronan, čokoláda (hořká), etanol, fenothiazin, fluoridy, fluosol-DA, furosemid, fytát, galiumnitrát, glukóza, hemoglobin (1 g/l), hlinité soli, hydrochlorothiazid, hydroxid hlinitý, inzulín, ketokyseliny, kofein, lipémie, lithium, manitol, menstruace, niacin, noradrenalin, orální kontraceptiva, pamidronát, poloha vleže, promethazin, prokain penicilin G, růstový hormon, těhotenství (také po porodu a ukončení kojení), aj.

Koncentraci fosfátů v séru zvyšují: anabolické steroidy, anestetika, antikonvulsiva, askorbová kyselina, alanin, aldatens, cefotaxim, celková bílkovina (120 g/l), cidovir, cis-platina, EDTA, ergokalciferol, erytropoetin, etidronát, etretinát, foscarnet, fosfenytoin, fototerapie, gasterin, ILGF-1, hemoglobin (> 3,5 g/l), 1-α-hydroxyvitamin D, imunoglobuliny, izoniazid, medroxyprogesteron, metyltestosteron, mestranol, nafarelin, nikardipin, paraprotein, Phospho-Soda, primidon, superanabolon, takrolismus, triacylglyceroly (> 25 mmol/l), xylitol, aj.

Koncentraci fosfátů v moči snižují: alanin, alkoholismus, skladování vzorku bez okyselení, aj.

Koncentraci fosfátů v moči zvyšují: acetazolamid, anopyrin, aqua carminativa, asparagináza, dihydrotachysterol, dilthiazem, floridzin, glycin, hlinité soli, hydrochlorothiazid, hydrouhličitany, gasterin, kalcitonin, kortikosteroidy, metolazon, rtuťná diuretika, ortofosfát, tryptofan, valin, aj.

Další informace

Postupy pro hodnocení vnitřního prostředí

Postupy pro hodnocení aktivit enzymů

Postupy pro hodnocení koncentrací léků a drog

Postupy pro hodnocení koncentrací lipidů

Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů

Petr Štern (2010-03-10)