Stanovení alaninaminotransferázy (ALT)
Synonyma
L-alanin:2-oxoglutarát
aminotransferasa, EC 2.6.1.2,
ALT;
alaninaminotransferasa, alaninaminotransferáza,
L-alaninaminotransferasa;
L-alanintransaminasa; β-alaninaminotransferasa;
alanin-α-ketoglutarátaminotransferasa;
alanin-pyruvátaminotransferasa; L-alanin-α-ketoglutarátaminotransferasa;
GPT;
glutamát-pyruváttransaminasa; glutamát-alanintransaminasa; glutamová
kyselina-pyrohroznová kyselina transaminasa; glutamát-pyruvátaminotransferasa;
pyruváttransaminasa;
pyruvát-alaninaminotransferasa; pyruvát-glutamáttransaminasa
Chemické názvosloví
připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných
lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý název jako
jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např.
aminotransferase) vždy samostatně.
Další informace
Preanalytická fáze
Sérum by mělo být analyzováno co nejdříve, nejlépe
v den odběru a neskladováno. Stabilita 20 až 25 °C 3 dny, 4 až 8 °C 7 dní, -20
°C pouze 2 dny! Skladování v lednici
je vhodnější než zmražení (skladování i při ‑ 40 °C vede ke ztrátě
katalytické koncentrace).
Stanovení ovlivňuje věk, hmotnost, požití alkoholu. Ruší silná hemolýza
(aktivita ALT je v erytrocytech 6x vyšší než v séru). Koncentrace hemoglobinu vyšší než 2,5 g/l vede ke
zvýšení aktivity ALT v referenčních mezích přibližně o 10 %. Naměřená
hodnota při odběru vsedě je o 14 % vyšší, než hodnota při odběru vleže. Pokud
se jako antikoagulans v plazmě použije citrát sodný, dochází k inhibici ALT. Fyzická zátěž hodnoty zvyšuje.
Popis metody
L-alaninaminotransferáza EC 2.6.1.2 katalyzuje přenos
–NH2 z L-alaninu na kyselinu 2-oxoglutarovou za vzniku kyselin
pyrohroznové a glutamové. Poločas vymizení ALT je 47 h.
Přenos aminoskupiny může probíhat i opačným směrem.
Pyruvát vznikající při reakci katalyzované
alaninaminotransferázou je dále redukován na laktát enzymem
laktátdehydrogenázou s využitím NADH jako koenzymu.
Rychlost úbytku koncentrace NADH je úměrná aktivitě ALT.
Stanovení aktivity ALT je založeno na měření poklesu
absorbance reakční směsi při 340 nm, dané změnou koncentrace redukované formy
NADH na oxidovaný koenzym oxidoreduktáz NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid)
ve spřažené reakci s LD.
Činidla
- Pufr Tris, L-alanin
(110 mmol/l Tris, 630 mmol/l -alanin, pH 7,5). Rozpustit
- Pufr
Tris/kyselina chlorovodíková (110 mmol/l Tris, pH 7,5). Rozpustit 2,64 g tris(hydroxymetyl)aminometanu v 160 ml
destilované vody. Upravit na pH 7,5 při 30° C pomocí 1 mol/l HCl. Roztok
se nechá ochladit na teplotu kalibrace a v odměrné baňce se doplní na
200 ml. Tento roztok (č. 2) je stabilní 6 měsíců při teplotě 0° až 4° C.
Nutno kontrolovat na kontaminaci bakteriemi každý týden.
- Roztok pyridoxalfosfátu
(6,3 mmol/l pyridoxalfosfátu). Rozpustit 16,7 mg pyridoxalfosfátu
v roztoku č. 2 a doplnit na objem 10 ml. Tento roztok (č. 3) je
stabilní 2 týdny při 0° to 4° C, je-li skladován v tmavé láhvi.
- Redukovaný
nikotinamidadenindinukleotid (11,3 mmol/l NADH). 16 mg sodné soli NADH
(nebo ekvivalentní množství korigované na hydrataci vodou) in 2,0 ml
roztoku 2. Tento roztok (č. 4) je stabilní 2 týdny při 0° to 4° C, je-li
skladován v tmavé láhvi.
- Laktátdehydrogenáza
(2500 µkat/l). Rozpustit enzym v
50% objemové směsi glycerolu a roztoku 8 (viz níže), abychom dostali
požadovanou katalytickou koncentraci. Tento roztok (č. 5) je stabilní 6
měsíců při teplotě 0° až 4° C.
- Pracovní činidlo
pro reakci s alaninaminotransferázou. Smíchat 1000 ml roztoku 1
(Tris-alanin) s 2 ml roztoku 3 (pyridoxalfosfát), 2 ml roztoku 4 (NADH) a
1 ml roztoku 5 (enzym). Tento roztok (č. 6) musí být připravovaný denně
čerstvý a poté skladovaný v tmavé láhvi.
- Směs činidel pro
sérový blank/alanin 630 mmol/l. Rozpustit 5,62 g D-alaninu (volná
kyselina) v 50 ml roztoku 2 (Tris-HCl). Upravit na pH 7,5 při 30° C pomocí
1 mol/l HCl. Přidat 2 ml roztoku 3 (pyridoxalfosfát), 2 ml roztoku 4
(NADH) a 1 ml roztoku 5 (enzym). Doplnit na 100 ml roztokem 2. Toto
činidlo (č. 7) musí být připravované denně čerstvé a poté skladované
v tmavé láhvi.
- Tris/2-oxoglutarát
(110 mmol/l Tris, 180 mmol/l 2-oxoglutarát, pH 7.5). Rozpustit
- Chlorid sodný
(154 mmol/l). Rozpustit
Přístrojové vybavení
Spektrofotometr se šíří spektrálního pásu 10 nm, umožňující měření při 339
nm s termostatovanou kyvetou s výkyvy < 0,05 °C (možnost
analogového zápisu se doporučuje).
- Do kyvety
dávkovat 2,000 ml roztoku 6 (pracovní činidlo) a 0,200 ml séra.
- Smíchat a nechat
stát 10 min.
- Sledovat
absorbanci, abychom se ujistili, že je její hodnota stabilní.
- Přidat 0,200 ml
roztoku 8.
- Zamíchat a sledovat
změnu absorbance alespoň 300 s. Není-li k dispozici zapisovač,
sledovat hodnotu každých 15 s.
Výpočet
Je-li změna absorbance/s (ΔA/s) > 0,00025 nebo
když klesá během kroku 3, je třeba ředit vzorek 5 až 10-krát roztokem 9 (0,154
mol NaCl/l).
Korekce na blank se provádí následovně:
(ΔA/s) A =
měření reakce séra s roztokem 6
(ΔA/s) B =
měření reakce roztoku 9 a roztoku 6
(ΔA/s) C =
měření reakce séra s roztokem 7
(ΔA/s) D =
měření reakce roztoku
Pak při optické dráze kyvetou 10 mm:
(ΔA/s) korigovaná = [(ΔA/s)A -
(ΔA/s)B] - [(ΔA/s)C
- (ΔA/s)D]
Poznámka
Používají se sterilizované nádoby, aby se zabránilo
růstu mikroorganizmů. Do roztoků 1,
Doporučená rutinní metoda stanovení: IFCC metoda pro 37 °C/ECCLS/DGKCh 94 new
(různá označení pro stejnou metodu). Toleranční limit EHK: 21%, CV % pro
VKK: 7 %, teoretický toleranční limit: 45,3 %.
Metody použitelné
pro screening
kyselina dinitrofenylhydrazin
pyruvát-dinitrofenylhydrazon
pyrohroznová
Tato reakce může nahradit kinetické měření v UV oblasti.
kyselina
dimetylaminobenzaldehyd
pyrohroznová
Pouze orientační reakce při epidemiologickém screeningu.
Poznámky k
analytické metodě
Doporučená metoda IFCC je v plném rozsahu obtížně aplikovatelná zvláště
u rychlých analyzátorů s velmi malým měřícím objemem.
Metoda musí být dvoučinidlová. Druhé činidlo je
pouze 2-oxoglutarát. V prvním činidle musí být bezpodmínečně NADH, LD, aby
došlo k likvidaci endogenního pyruvátu v měřeném materiálu před přidáním
druhého činidla. Některé firmy označují svůj postup « like IFCC » a
přitom mají NADH ve druhém činidle, kde se snadněji udrží jeho stabilita.
Doporučovaná inkubace s prvním činidlem je 5 min,
po přidání druhého činidla 90 s a doba měření 180 s. Většina analyzátorů
neumožňuje reakční čas 9,5 min. Nicméně doporučujeme co nejméně zkracovat
inkubaci s prvním činidlem. Dostačující fáze prodlevy po přidání druhého
činidla je 30 s, pro měření 60 s (minimálně 6 bodů). Jestliže je maximální
reakční čas analyzátoru 6,5 min, nezkracujte inkubaci s prvním činidlem vůbec.
Pokud není jiná možnost zkraťte ji tak, abyste zcela naplnili maximální reakční
čas analyzátoru. Čím více budete tuto fázi analýzy zkracovat, tím více
zvyšujete riziko falešně vyšších výsledků u pacientů s vysokou hladinou
endogenního pyruvátu.
V buňkách se vyskytuje holoenzym ALT
(apoenzym + koenzym), ale
v séru může být již část ALT zbavená koenzymu. Proto reakce vyžaduje
vysycení ALT pyridoxalfosfátem (kofaktor přenosu aminoskupin). Pokud nepoužijete vitamin B6, jedná se o postup non
lege artis. Pyridoxalfosfát je vždy v prvním činidle. Vysycení
probíhá zvolna a to je další důvod, proč se nemá první inkubace zkracovat. Čistý apoenzym se také často vyskytuje v kontrolních sérech, které
jsou obohacovány čištěnými enzymy.
Metody bez přídavku pyridoxalfosfátu dávají až o
20 % nižší výsledky. Doporučená délka optické
dráhy kyvetou je 10 mm, některé analyzátory mají jen 7 mm. S tím se nedá nic
dělat, ale je třeba si uvědomit, že citlivost měření se snižuje asi o jednu
třetinu.
Doporučená minimální koncentrace NADH je 180
µmol/l, aktivita LD 28,3 µkat/l. Jsou to drahé chemikálie a firmy někdy šetří.
Nicméně vyšší koncentrace, resp. aktivity uvedených reagencií nevadí.
Poměr vzorku a reakční směsi 1:12, takže
použijete-li sumárně 160 µl činidel je třeba dávkovat 15 µl vzorku. Linearita
metody je za těchto podmínek přibližně do 6,3 µkat/l. Certifikovaný referenční materiál není zatím dostupný.
Interference
Snížené aktivity ALT jsou u metronidazolu.
Řada léků způsobuje zvýšení aktivity ALT:
acyklovir, acylpyrin, adrenalin, allopurinol, antibiotika včetně syntetických
penicilinů, amoklen, ampicilin, cefoxitin, ciprofloxacin, dietylstilbestrol,
dikumarol, doxorubicin, erytromycin,
esterifikované estrogeny, fenobarbital, fenotiazin, fenytoin, flukonazol,
flutamid, furosemid, gentamicin, chloramfenikol, inhibitory
hydroxymetylglutarylkoenzym A reduktázy včetně atorvastatinu, lovastatinu,
pravastatinu a simvastatinu, ibuprofen, interleukin-2, izoniazid, karbamazepin,
karbenicilin, ketokonazol, mefenamová kyselina, meprobamat, metotrexat,
metyldopa, metyltestosteron, naproxen, nesteroidní protizánětlivé léky jako
acetaminofen a aminosalicylová kyselina, nitrofurantoin, progesteron,
pyrazinamid, rifampin, sulfonované léky (např. sulfonylmočovina), tiazidy,
tikarcilin, tolbutamid, trimetoprim, troleandomycin, valproová kyselina,
zidovudin a j.
Další informace
Postupy
pro hodnocení aktivit enzymů
Petr Štern, 2009-07-24