Stanovení bilirubinu
Synonyma
2,17-dietenyl-1,10,19,22,23,24-hexahydro-3,7,13,18-tetrametyl-1,19-dioxo-21H-bilin-8,12-dipropanová
kyselina;
1,10,19,22,23,24-hexahydro-2,7,13,17-tetrametyl-1,19-dioxo-3,18-divinylbilin-8,12-dipropanová
kyselina;
1,3,6,7-tetrametyl-4,5-dikarboxyetyl-2,8-divinyl-(b-13)-dihydrobilenon; bilirubin IXα; celkový bilirubin; hematoidin, haematoidin.
TBIL (Google 23 200) není oficiální zkratkou i když je uvedena v Lab Tests Online.
Preanalytická fáze
Stanovení v séru se dává přednost, neboť lze stanovit
současně přímý i celkový bilirubin. Při stanovení celkového bilirubinu
v plazmě (Malloy-Evelynová) vlivem alkoholu dochází k precipitaci
bílkovin, což ruší při stanovení.
Zabraňte hemolýze při odběru. Vzorky nutno chránit před teplem a světlem.
Účinkem intenzivního slunečního záření dochází k poklesu koncentrace
bilirubinu až o 30 – 50 % za 1 h.
Stabilita vzorku ve tmě sérum: 20 – 25 °C 2 dny,
2 – 8 °C 3 – 7 dnů, -20 °C 3 – 12 měsíců; plazma (antikoagulans heparin nebo
EDTA): 18 – 26 °C 2 dny, 2 – 8 °C 4 – 7 dnů, -20 °C 1 rok; konjugovaný bilirubin sérum: 20 – 25 °C 1 den, 4
– 8 °C 5 dní, -20 °C 6 – 12 měsíců; pupečník:
2 - 8 °C 2 dny, -20 °C 14 týdnů.
Sběr moči za 24 hodin je zejména v ambulantní praxi nejvíce chybami zatížený postup. Až u 35 - 50 % pacientů nebývá dosaženo spolehlivého sběru. Nejčastější chybou je subjektivní opomenutí pacienta sebrat veškerou moč (vymočení před defekací, nedodržení časových intervalů). Určitou kontrolou může být stanovení kreatininurie a srovnání s obvyklými hodnotami. V moči lze stanovit pouze konjugovaný bilirubin.
Celkový i konjugovaný bilirubin lze stanovit také v mozkomíšním moku.
Poznámky k analytické metodě
V séru lze stanovit různé frakce bilirubinu:
Většina metod fotometrického stanovení bilirubinu
(celkového nebo pouze jeho konjugátů s kyselinou glukuronovou) vychází
z reakce s diazotovanou kyselinou sulfanilovou (diazotace). Stanovení
dle Doumase-Perryho vychází z původní metody dle Jendrassika a Grófa.
Produktem reakce je barevný azobilirubin, který je při slabě kyselém a
neutrálním pH červený, v silně kyselém pH a v bazickém prostředí
zelenomodrý. V přítomnosti akcelerátoru (směs kofeinu, octanu sodného a
benzoanu sodného) dochází k uvolnění nekonjugovaného bilirubinu
z vazby na albuminu a stanoven je tak celkový bilirubin. Metoda má
výbornou výtěžnost a interferuje při ní pouze zinek.
Bez akcelerátoru reaguje s diazo činidlem
pouze konjugovaný bilirubin (rozpustný ve vodě) a δ-bilirubin
(bilirubin kovalentně vázaný na albumin) tzv. přímý bilirubin. Produkt
diazotace bez akcelerátoru se stanovuje po určité krátké době, která stačí
k diazotaci přímých forem bilirubinu (~ 10 min), kdy se zastaví reakce
kyselinou askorbovou (dojde k rozložení diazoniové soli potřebné pro
kopulaci).
Bilirubin nekonjugovaný musí být nejprve uvolněn
z vazby na albuminu a rozpuštěn akcelerátorem; proto se označuje jako tzv.
nepřímý bilirubin. Pak se může (pH 13), ale nemusí (pH 6,5) provést alkalizace
(roztok NaOH s vínanem sodnodraselným). Postup dle Jendrassika–Grofa
používá kyselinu askorbovou, aby se minimalizoval vliv hemoglobinu a také sérový
blank, aby se eliminovalo endogenní zbarvení.
Pro rozpuštění nekonjugovaného bilirubinu lze
použít kromě směsi kofeinu, octanu sodného a benzoanu sodného také jiná
rozpouštědla, např. antipyrin-metanol, močovinu nebo dimetylsulfoxid. Postup
Malloy-Evelynové probíhá při pH 1,2 v metanolu, případně
v dimetylsulfoxidu. Výsledky touto metodou jsou nižší než postupem Jendrassika–Grofa.
Enzymová
metoda pro stanovení bilirubinu používá bilirubinoxidázu (EC 1.3.35) z Myrothecium
verrucaria, která katalyzuje oxidaci bilirubinu na biliverdin, což se sleduje 5
min jako pokles absorbance při 405 – 460 nm. Přímý bilirubin se stanovuje při
pH 4,5; celkový po přidání akcelerujících detergentů při pH 8,5. Jako
akcelerátory jsou laurylsíran sodný a cholan sodný, které uvolňují bilirubin
z vazby na albumin. Reprodukovatelnost metody je 4 – 8 % v normálním
rozmezí hodnot, při hyperbilirubinémii i lepší. Korelace s neenzymovými
metodami je dobrá a navíc neruší hemolýza. Vzhledem k vysoké specifitě
enzymu by metoda mohla být v budoucnu jako referenční.
Bilirubin může být také oxidován kyselinou
vanadičnou na biliverdin. Dva body absorbance před oxidací a po oxidaci (po 3
min). Stanovovat lze přímý bilirubin i celkový bilirubin (s kationaktivním
detergentem cetyltrimetylamoniumbromidem jako akcelerátorem).
U novorozenců
lze použít přímé bichromatické stanovení při
HPLC
separuje metylestery konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu, které můžeme
kvantifikovat. Postup může být v budoucnu referenční metodou.
Možnost transkutánního měření bilirubinu bichromaticky reflexním fotometrem při 460 a
550 nm dává
dobrou shodu s měřením v séru, ovšem je to pouze ten bilirubin, který
se ze séra dostane do tkání.
Při použití
vícevrstvého filmu se aplikuje Jendrassikova–Grofova reakce při stanovení
celkového bilirubinu, který se váže na hydrofobní katex polyesterového
filmu. V důsledku toho vzniká
spektrální posun a nekonjugovaný bilirubin má vyšší absorbanci při 460 nm než
konjugovaný bilirubin. Proto se měří ještě při 400 nm a δ-bilirubin je pak
rozdíl mezi celkovým bilirubinem a konjugovaným + nekonjugovaným bilirubinem.
Vychýlení mezi
vícevrstvým
filmem a Jendrassikovou–Grofovou fotometrickou metodou ukazuje na schopnost
suchého filmu rozlišit mezi δ-bilirubinem a glukuronidem bilirubinu.
Bichromatické měření eliminuje vliv hemoglobinu a karotenů. Vícevrstvým filmem
lze měřit i konjugovaný bilirubin separátně a tak rozlišit konjugovaný,
nekonjugovaný a δ-bilirubin.
Bilirubin
byl také stanoven derivační spektrometrii anebo fluorimetricky anebo kapilární
elektroforézou.
Pro celkový bilirubin je referenční metodou
Doumasova-Perryho metoda.
Certifikovaný referenční materiál: neexistuje. Jako
sérový kalibrátor se prozatím doporučuje čistý bilirubin z Národního
ústavu pro standardy a technologie NIST 916. Také konjugovaný bilirubin je
komerčně dostupný (Ultimate D, Beckman) a lze ho použít pro standardizaci
stanovení přímého bilirubinu.
Doporučené rutinní metody stanovení:
Jendrassikova-Grófova metoda, fotometrické metody s 2,4-dichloranilinem
nebo 2,5-dichlorfenyldiazoniovou solí.
Intraindividuální variace bilirubinu je 4 – 5
µmol/l. Toleranční limit EHK: 21 %, reprodukovatelnost CV 7 %, teoretický
toleranční limit: 36 %.
Proužky pro měření bilirubinu v moči používají obvykle diazoniové soli 2,4-dichloranilinu nebo 2,6-dichlorbenzen-diazonium fluoroborát, případně triazen. Kyselé prostředí vytváří katexová matrice. Ve všech metodách při stanovení v moči interferuje endogenní zbarvení moče.
Referenční (kontrolní) materiál nelze připravit z
důvodů nestability konjugovaného bilirubinu v matrici s normálním pH a iontovou
silou. Proto se nejčastěji používá moče pacientů s patologickými hodnotami
bilirubinu, které jsou analyzovány různými typy proužků. Metoda pro
kvantitativní stanovení bilirubinurie (analogicky se sérovým stanovením) není
vypracována.
HPLC výsledky ukazují, že plazmě zdravých osob je
< 5 % konjugovaného bilirubinu, ale většina diazo metod koncentraci této
frakce značně nadhodnocuje. Navíc HPLC prokázala přítomnost nebilirubinových
látek, které také poskytují diazo reakci. Některé sloučeniny, které jsou
přítomné v moči jako mezobilifuscin a uroerytrin interferují při močové
analýze a podobné látky lze přepokládat v plazmě. Množství stanoveného
přímého bilirubinu závisí na délce reakce a teplotě měření.
Interference
Koncentraci bilirubinu snižují: askorbová kyselina, askorutin,
fenobarbital, fyziologický roztok – infuze, nitrity (moč), nutramin,
parenterální výživa, oxidace (delší stání moče), vitamin C aj.
Koncentraci bilirubinu zvyšují: acetaminofen, amikin, aminosalicylová kyselina, anabolické steroidy, azathioprin, biliverdin, cyklosporin, erytromycin, esterifikované estrogeny, etanol, fenazopyridin (moč), fenothiaziny, fruktóza infuze, gentamycin, glukóza infuze, hemoglobin, histidin, hladovění, chlorpromazin (moč), inderal, indikan, indinavir, indometacin, interleukin-2, izoniazid, karoten, klindamycin, kodein, lipémie, MAO inhibitory, mefenytoin, metyldopa, 3,4-metylendioxymetamfetamin, nalidixová kyselina, nortriptylin, oleandomycin, orální kontraceptiva, penicilin, plegomazin (moč), prokainamid, progesteron, propylthiouracyl, pyrazinamid, spasmoveralgin, sulfasalazin, sulfonamidy, trimekryton, trimepranol, tyrosin, valproová kyselina, visken, viskenit, vitamin A, warfarin, xylitol aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2010-03-08