Stanovení C3 komplementu
Synonyma
složka C3 komplementu, složka C3c komplementu (pouze část C3), β1C-globulin, β1C-protein, ARMD9 (age-related macular degeneration), ASP (amnesic shellfish poisoning), CPAMD1 (alpha-2-macroglobulin domain-containing protein 1).
Poznámka: někdy sem bývají nesprávně řazeny také CH50 a
CH100 (procento lýzy buněk celého komplementu) – to odpovídá ale součtu C3 + C4
(správněji C1 až C9).
Preanalytická fáze
Odběr nalačno není nutný. Analýza se provádí v plazmě (koagulant
EDTA, heparin nebo citronan) nebo séru, případně v likvoru.
Stabilita vzorku (plazma, sérum): 18 - 26 °C 1 – 4 dny, 2 - 8 °C 1 týden, -20 °C 12 týdnů. Nicméně se také uvádí, že maximální čas od získání do zpracování vzorku je 1 den při doporučené teplotě 4°C. V průběhu skladování dochází v séru k pomalé defragmentaci C3 proteinů na C3 komponenty (fragmentace je inhibována EDTA). Tyto fragmenty stále obsahují reaktivní epitopy, které mohou způsobit zvýšení signálu pro intaktní protein. V souvislosti s defragmentací u čerstvého séra může být naměřena koncentrace C3 až o 30 % nižší než u séra skladovaného 8 dní při teplotě 2 – 8 °C. Skladování při -20 °C je možné po delší dobu (3 měsíce, ale Roche uvádí jen 8 dní). Pro delší skladování se doporučuje -70 °C. Krevní elementy je nutné oddělit do 1 h po odběru. Opakované zamrazení vzorku se nedoporučuje.
Stanovení ruší chylozita a stáří séra (dochází ke zvyšování hladiny C3). V těhotenství a menopauze jsou výsledky vyšší, naopak v době 6 měsíců po porodu nižší.
Poznámky k analytické
metodě
Stanovení C3 se provádí imunonefelometricky (preciznost v sérii CV 1,0 – 3,4 %; vychýlení ‑1,2 %), imunoturbidimetricky (celková reprodukovatelnost CV 1,6 – 2,2 %; vychýlení -1,2 až +17,6 %; výtěžnost 90 – 110 %; efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do koncentrace C3 komplementu 12,5 g/l), elektroimunodifuzí nebo radiální imunodifuzí (preciznost mezi sériemi CV 4,3 – 8,3 %). Vzhledem k tomu, že při skladování séra dochází k přechodu složky C3 na C3c (má nižší Mr než C3) a C3d není pro kvantitativní stanovení vhodná metoda jednoduché radiální imunodifuze. Také při imunonefelometrii a imunoturbidimetrii se při skladování séra projeví falešná pozitivita a zvýšení závisí od použité protilátky.
Komerčně dostupná je kompetitivní ELISA (POD marker) na mikrotitračních destičkách (opakovatelnost CV 4,4 %; reprodukovatelnost mezi sériemi 7,5 %; výtěžnost 80 – 105 %). Lze použít také imunofluorescence s FITC jako markerem (preciznost v sérii CV 3,1 %; mezi sériemi 9,3 %).
Je také popsána western blot analýza.
Při
elektroforéze bílkovin se C3 pohybuje v oblasti β2-globulinů. Tato
zóna je téměř výhradně tvořena C3 složkou komplementu. Při delším skladování
séra dojde k degradaci C3. Fragment C3c způsobí rozostření a rozšíření
β1 a souběžně dojde k poklesu β2. Postupem času může dojít
vlivem degradace až k vymizení frakce β2.
Referenční metoda neexistuje, certifikovaný
referenční materiál: CRM 470 (IRMM Geel, Belgie) je pro složku C3c komplementu.
Protože imunochemická reaktivita C3 a C3c je odlišná, byl veškerý C3 v CRM
470 převeden na C3c a stabilizován.
HPLC nebo dokonce LC/MS slouží jen pro vědecké
studie vyžadující podrobnosti o jednotlivých složkách C3 komplementu.
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Výsledky stanovení C3 snižují: chlorpromazin, rtg kontrastní látky, malnutrice aj.
Výsledky stanovení C3 zvyšují: krátkodobé zahřívání (30 min, 56 °C), interleukin-6.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2010-03-08