Stanovení celkových
proteinů v likvoru
Synonyma
Total protein, celkový protein.
Zkratky CB nebo TP (uvedena v Lab Test Online) nejsou
oficiálními zkratkami.
Preanalytická fáze
Stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 24 h, 4 – 8 °C: 1 týden, -20
°C: 1 rok. Odběr do zkumavek bez úpravy nebo s EDTA (pro současné
stanovení buněčných elementů). Do 1 h od odběru centrifugovat, ale nechladit.
Transport možný do 3 h na lázni s tajícím ledem. Zmrazit lze na ‑20
až -70 °C v dobře utěsněných skleněných nebo polypropylenových zkumavkách.
Zvýšená hodnota může být při hemolýze nebo lipémii.
Stanovení ovlivňuje heterogenita vzorku.
Poznámky k analytické
metodě
Zákalové metody (turbidimetrie, nefelometrie) předpokládají tvorbu jemných homogenních sraženin proteinů (řízená velikost částic), které rozptylují dopadající světlo. Precipitace se provádí sulfosalicylovou nebo trichloroctovou kyselinou, případně protilátkami. Velmi citlivá je turbidimetrie při 330 nm. Tyto metody se provádějí hlavně při stanovení celkové bílkoviny v moči a mozkomíšním moku. Reakce je lineární od meze stanovitelnosti 0,1 g/l do 3,5 g/l (při srážení kyselinou chlorovodíkovou je reakce ještě 10-krát citlivější). Nevýhodou metody je velká spotřeba vzorku (200 µl).
Je možné také vysrážet celkovou bílkovinu v moči a mozkomíšním moku kyselinou trichloroctovou, precipitát rozpustit v biuretovém činidle a poté stanovit podobně jako sérum. Linearita této reakce je 0,11 - 1,6 g/l.
Schopnost proteinů vázat barviva jako je Amidočerň 10B a Coomassie Brilliant Blue G-250 se využívá k fotometrické detekci. Coomassie Brilliant Blue G-250 váže protonizovanou aminoskupinu aminokyselinových zbytků polypeptidového řetězce a maximum absorbance barviva 465 nm poklesne a 595 nm vzroste. Metoda je rychlá, jednoduchá a citlivá, ale má úzkou oblast linearity (0,002 - 1,2 g/l) a interferují při ní povrchově aktivní látky (Triton, laurylsíran sodný). Preciznost v sérii CV kolem 2 %, mezi sériemi 7 %. Tato metoda se používá ke stanovení celkové bílkoviny v moči, mozkomíšním moku, mateřském mléce a při vybarvování proteinových pásů po elektroforéze. Coomassie Brilliant Blue G-250 má podstatně vyšší citlivost vůči albuminu ve srovnání s globuliny, takže v případě vyššího zastoupení globulinů jsou výsledky podhodnoceny.
Úzkou oblast
linearity má také barevná reakce s
tanin-chloridem železitým (linearita 0,03 - 1,0 g/l).
Vhodnější je reakce při které pyrogalolová červeň
s molybdenanem sodným tvoří komplex s bílkovinou absorbující při 600
nm (linearita 0,01 - 16,0 g/l). Preciznost
v sérii CV < 4 %, mezi sériemi < 10 %. Použití
vhodného proteinového kalibrátoru umožňuje dosáhnout velmi dobré korelace mezi
metodami s Coomassie Brilliant Blue
G-250 a pyrogalolovou červení (r = 0,98 až 0,99).
Toleranční limit EHK pro stanovení celkové bílkoviny v likvoru: CV 27 %.
Interference
Koncentraci celkové bílkoviny snižuje vyšší relativní
zastoupení albuminu.
Koncentraci celkové bílkoviny zvyšují: bilirubin, dirastan, globuliny, hemolýza, 5-hydroxyindoloctová kyselina, olovo, penicilin, serotonin, tryptofan, zákal, tyramin, tyrosin aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2010-03-08