Synonyma

Allocar, Cardioerg, Digacin, Lanicor, Lanocor, Lanoxicaps, Lanoxin, Lenoxin, Purgoxin

Preanalytická fáze

Odběr nejméně 6 h, lépe 8 - 24 h po aplikaci, rovnovážný stav je dosažen nejdříve 5 dnů po zahájení aplikace. Stanovení se provádí v plazmě (antikoagulans K₂EDTA nebo heparinát lithný) nebo séru. Odběr se provádí 8 – 24 h po aplikaci. Je třeba zabránit hemolýze !

Stabilita vzorku 20 – 25 °C (sérum): 24 h, 20 – 25 °C (plazma) 1 týden, 4 – 8 °C (sérum, plazma): 1 týden, -20 °C (sérum, plazma): 1 rok. Kaplan a spol. uvádí stabilitu vzorku za laboratorní teploty 2 týdny. Rozmrazení vzorků se doporučuje pouze jednou.

Poznámky k analytické metodě

Imunochemické postupy jsou nejběžnější a mohou být plně automatizované.. Používá se radioimunoanalýza, enzymová imunoanalýza (EMIT i imunoenzymometrická) a fluorescenční homogenní polarizační technika (FPIA), dále technologie MEIA a chemiluminiscenční analýza.

Pro RIA byl původně k dispozici pouze ³H-digoxin, ale jako beta-zářič musel být analyzován kapalným scintilačními detektory. To je ve srovnání s gama-počítači drahé a nepohodlné. Proto byla k digoxinu nebo digoxigeninu připojena snadné jodovatelná funkční skupina (tyrosin, histamin nebo tyramin). Pro separaci v RIA se nejčastěji používá dextran potažený aktivním uhlím. Pro ¹²⁵I-digoxin se uvádí reprodukovatelnost CV mezi sériemi 2,9 – 9,2 %. Směs značeného a neznačeného digoxinu lze také prolít kolonou se zakotvenou protilátkou a pak při následné RIA detekci dosáhnou reprodukovatelnosti v sérii 10 % a mezi sériemi 12 %.

Imunoturbidimetrický postup používá latexové částice potažené digoxinem, které soutěží o omezený počet vazebných míst na protilátce s digoxinem ze vzorku. Senzitivita metody je 0,19 nmol/l, reprodukovatelnost v sérii 2,3 – 5,1 %, mezi dny 2,7 – 4,5 %.

EMIT používá jako značku glukóza-6-fosfátdehydrogenázu a kompetitivní uspořádání imunochemické reakce. Citlivost je poměrně malá, což je způsobeno stérickou zábranou po reakci konjugátu antigen-enzym s protilátkou a homogenním kompetitivním uspořádáním. Vyžaduje se úprava vzorku před analýzou. Reprodukovatelnost v sérii CV < 8 %, mezi sériemi < 10 %.

Citlivá imunoenzymometrická analýza probíhá na afinitní koloně. Fragment F(ab´)₂ protilátky proti digoxinu je označen b-galaktosidázou. Přebytek tohoto konjugátu je inkubován se vzorkem. Úprava vzorku před analýzou není nutná. Po inkubaci se směs nalije na afinitní kolonu Sephadex G-10 na kterém je přes albumin vázán digoxinový analog (ouabain), přes kterou se dostane pouze konjugát s navázaným digoxinem. Poté b-galaktosidáza z imunokomplexu rozštěpí o-nitrofenyl-b-D-galaktopyranosid a sleduje se nárůst absorbance při 405 nm. Touto metodou CEDIA bylo dosaženo reprodukovatelnosti v sérii CV 101 – 3,0 %, mezi sériemi 3,5 – 12,0 %.

Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze (FPIA). Preanalytická úprava se vyžaduje u pacientů s příliš nízkou nebo vysokou bílkovinou, protože digoxin se váže na bílkoviny. Reprodukovatelnost v sérii CV 2,37 – 5,41 %, mezi dny 1,93 – 5,71 %, vychýlení -6,7 % až +14 %.

DELFIA je další kompetitivní postup, který využívá fluorescence europia rozložené v čase.

Při chemiluminiscenční analýze se jako marker používá ALP a substrátem je adamantyldioxetanfenylfosfát. Reprodukovatelnost v sérii CV 3,5 – 5,7 %.

Národní komise pro klinické standardy a Americká asociace klinické chemie uvádějí jako kandidátní referenční metodu RIA postup s tritiem značeným digoxinem a aktivním uhlím jako separačním činidlem. Metodě byla dána přednost před značením ¹²⁵I, protože ³H-digoxin je stabilnější a dostupný ve vysoké kvalitě. Předběžné údaje ukazují reprodukovatelnost v sérii CV < 5 %.

Dále jsou k dispozici metody na principu plynové chromatografie, inhibice aktivované ATPázy v erytrocytech nebo mikrosomech digoxinem a izotopové výměny. Tyto metody jsou pracné a rutinně se nepoužívají.

Plynová chromatografie používá ³H- digoxin jako vnitřní standard. Před analýzou je nutné vzorek čistit TLC a derivatizovat, což je pracné a časově náročné.

K dispozici je také stanovení HPLC s MS-MS detekcí.

Inhibice ATPázy aktivované sodnými a draselnými ionty vyžaduje před analýzou extrakci vzorku. Je pracná, časově náročná a také méně precizní a specifická ve srovnání s RIA.

Izotopová výměna se týká ³H-ouabainu a čištěné Na-K ATPázy po reakci s digoxinem. Před analýzou je nutná extrakce a k dispozici musí být beta-počítač. Stanovení je pracné a nespecifické.

Toleranční rozpětí v EKK je 24 %.

Interference

Výsledky stanovení digoxinu snižují: p-aminosalicylová kyselina, antacida, anticholinergika, Colestipol, Gasterin, hemoglobin, cholestyramin, kaolin-pektin, metoklopramid, neomycin, otruby, sulfasalazin aj.

Výsledky stanovení digoxinu zvyšují: amiodaron, bilirubin (FPIA), Cerucal, cyklosporin, Depersolon, digitoxin, diltiazem, erytromycin, chinidin, indometacin, itrakonazol, Lanatosid C, látky s imunoreaktivitou podobnou digoxinu (u FPIA a MEIA snižují !), nicardipin, propaferon, proteázové inhibitory, Sodanton, Siro, spironolakton, Tac, tetracyklin, triamteren, verapamil, žlučové kyseliny aj.

Další informace

Principy analytických postupů

Postupy pro hodnocení aktivit enzymů

Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů

Petr Štern, 2010-03-10

Stanovení digoxinu