Stanovení fenobarbitalu
Synonyma
Barbita, Comizial, Fenilcal,
Gardenal, Hysteps, Luminal, Phenemal, Phenemalum, Phenobarb, Phenobarbital, Phenobarbitone,
Phenylethylmalonylurea, Solfoton, Stental Extentabs
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v plazmě (antikoagulans K2EDTA
nebo heparinát lithný či sodný), séru nebo moči.
Stabilita vzorku 20
– 25 °C (sérum, plazma): 1 týden, 4 – 8 °C (sérum, plazma): 4 dny, -20 °C
(sérum, plazma): 2 roky.
Poznámky k analytické metodě
Imunochemické postupy jsou nejběžnější a mohou
být plně automatizované. Používá se EIA, FPIA, chemiluminiscenční imunoanalýza,
imunonefelometrie, imunoturbidimetrie, GLC a HPLC.
ELISA na mikrotitračních destičkách potažených polyklonální protilátkou proti
fenobarbitalu využívá kompetice fenobarbitalu ze vzorku a fenobarbitalu
značeného křenovou peroxidázou o její vazebná místa. Výsledné zbarvení
tetrametylbenzidinu se měří při 450 nm. Reprodukovatelnost v sérii je CV
7,67 – 11,7 %.
EMIT používá jako značku glukóza-6-fosfátdehydrogenázu a kompetitivní
uspořádání imunochemické reakce.
Reprodukovatelnost v sérii CV 1,0 – 2,6 %, mezi sériemi 11 – 19 %;
vychýlení -6 až +10 %; výtěžnost 92 – 102 %.
Kapilární elektrochemická enzymová imunoanalýza je heterogenní kompetitivní postup, kdy je
oxidovaná primární protilátka připojena kovalentně na vnitřní povrch
mikrokapiláry (22 µl). Po kompetici mezi fenobarbitalem ze vzorku a
fenobarbitalem značeným ALP se množství enzymového produktu detekuje štěpením
p-aminofenylfosfátu na p-aminofenol amperometrickou průtokovou vstřikovací
analýzou.
Fluorescein jako marker se používá při homogenní
fluorescenční polarizační imunoanalýze (FPIA). Reprodukovatelnost
v sérii CV 3,7 %, mezi dny 6,2 %; výtěžnost 90 – 103 %.
Fluorescenční imunoanalýzu lze kombinovat i
s vylučovací chromatografií. Po kompetitivní imunoreakci mezi
fenobarbitalem a fenobarbitalem značeným fluoresceinem o omezený počet
vazebných míst protilátky jsou produkty separovány podle velikosti
v krátké kolonce a gelem a sleduje se jejich fluorescence. Reprodukovatelnost v sérii CV 7,32 –
9,48 %, mezi dny 5,38 – 10,05 %; vychýlení -8,27 až -4,97 %.
Chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení používá např. ALP
jako značku a adamantyldioxetanfenylfosfát jako substrát.
Imunonefelometrická a imunoturbidimetrická
analýza používá myší
monoklonální protilátku proti fenobarbitalu v přebytku, na kterou se
naváže fenobarbital ze vzorku.
Fenobarbital je navázán také na latexové částici a vytvoří
s neobsazenou protilátkou polymer, který precipituje. Při nefelometrií
v kinetickém režimu byla reprodukovatelnost v sérii CV < 4,0 %,
mezi dny < 4,2 %.
Plynová chromatografie může pro detekci používat hmotnostní detektor.
K dispozici je také stanovení HPLC na
koloně C18 s acetonitrilem jako mobilní fází
v trimetylamoniumfosfátovém pufru. Reprodukovatelnost v sérii CV je
< 5,6 %.
Toleranční rozpětí v EKK je 24 %.
Interference
Výsledky stanovení fenobarbitalu snižují: bilirubin (> 510
µmol/l), etanol, hemoglobin (> 10 g/l), karbamazepin, kyselina glutamová,
pyridoxin, rifampin, aj.
Výsledky stanovení fenobarbitalu zvyšují: fenytoin, furosemid, kyselina valproová (10 -20 %), ostatní barbituráty (nejvíce secobarbital 93,3 %, butabarbital 67,3 %, aprobarbital 33,7 %, amobarbital 22,7 %, butalbital 14 %), salicyláty (10 -20 %), aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2010-03-10