Stanovení fibronektinu
Synonyma
globulin nerozpustný za studena (cold-insoluble globulin), faktor zabraňující želatinaci (anti-gelatin factor)
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v plazmě (antikoagulans K2EDTA
nebo heparinát lithný), séru nebo supernatantu buněčných kultur, vaginálním
výtěru, případně v moči. Odstranění buněčných elementů je zapotřebí co nejdříve
po odběru. Při vysoké koncentraci fibronektinu může dojít k efektu
nadbytku antigenu.
Stabilita vzorku: 4 – 8 °C (sérum, plazma): 24 h, -20 °C
(sérum, plazma): pro delší uchování vzorků. Nicméně jinde je uvedeno, že při
teplotě 37 °C nebo 4 – 8 °C vzorky neztrácejí žádnou aktivitu po 72 h.
Rozmrazení vzorků se doporučuje pouze jednou (u ředěných vzorků je i tak ztráta
reaktivity přibližně 30 %) a pozvolna.
Poznámky k analytické
metodě
Imunochemické postupy jsou nejběžnější a mohou
být plně automatizované. Používá se ELISA, turbidimetrie a laserová
nefelometrie.
Jednoduché provedení nabízejí sendvičové ELISA
soupravy na mikrotitračních destičkách, potažených protilátkou proti
fibronektinu. Po navázání fibronektinu se v dalším kroku přidá druhá
biotinylovaná protilátka a peroxidáza s navázaným streptavidinem, který se
spojí s biotinem. Po odstranění přebytku peroxidázy se přidá tetrametylbenzidin
a vzniklé zbarvení se sleduje vertikální fotometrií při 450 nm. Průměrná
reprodukovatelnost v sérii je CV 5,3 % (2 – 10 %), mezi sériemi 6,7 % (6,2
– 9,7 %); výtěžnost 109,4 % (93,2 – 122,6 %).
Jiný ELISA postup používá králičí antisérum proti
fibronektinu. Na protilátku se váže fibronektin ze vzorku a fibronektin značený
ALP. Pak se přidá druhá protilátka (kozí γ-globulin proti králičímu
antiséru). Sraženina se centrifuguje a k precipitátu se přidá p-nitrofenylfosfát.
Vzniklý p-nitrofenol se měří při 403 nm. Reprodukovatelnost v sérii je CV
6,8 %, mezi sériemi 25,4 %.
Membránová imunoanalýza má na pevné fázi
zakotvenou polyklonální kozí protilátku proti fibronektinu a druhá monoklonální
protilátka (FDC-6) pro vytvoření fibronektinového sendviče je značená enzymem.
Turbidimetrické metody využívají
kozí nebo ovčí protilátky proti lidskému fibronektinu a detekce se provádí při
340 nm v E.P. nebo kinetickém režimu. Reprodukovatelnost v sérii je
CV 5,5 – 8,5 %, mezi sériemi 15,4 – 20,7 %.
Nefelometrická metoda používá
králičí antisérum proti lidskému fibronektinu. Reprodukovatelnost v sérii
je CV 0,38 %, mezi sériemi 1,9 %.
Další metody se v laboratorní praxi běžně
nepoužívají.
IRMA technologie používá zkumavek s protilátkou
proti fibronektinu na kterou se váže fibronektin a po propláchnutí se přidává
myší nebo králičí imunoglobulin značený 125I. Metoda je zdlouhavá.
Při raketkové elektroimunodifuzi
se používá gel s protilátkami proti fibronektinu ve veronalovém pufru.
K vybarvování slouží Coomassie
Brilliant Blue R-250.
Reprodukovatelnost CV mezi sériemi je 8,3 %.
Interference
Výsledky stanovení fibronektinu snižují: delší skladování vzorku v lednici (> 24 h), hladovění, nízká porodní hmotnost, aj.
Výsledky stanovení fibronektinu zvyšují: obezita, těhotenství, tyroxin, aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Petr Štern, 2010-03-10