Stanovení cholesterolu
Synonyma
celkový cholesterol,
cholest-5-en-3-ß-ol,
(10R,13R)-dimetyl-17-(6-metylheptan-2-yl)-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodekahydro-1H-cyclopenta[a]fenantren-3-ol
Preanalytická fáze
Odběr nalačno, vhodná doba lačnění je 12 hodin; večer před plánovaným odběrem krve pacient nejí maso, nepije mléko, neukouří a nepožívá alkohol. Krev se odebírá vsedě (rozdíl mezi hodnotami vsedě a vleže je 6 až 15 %), delší použití manžety je nevhodné. Tři minutová komprese vény může zvýšit koncentraci cholesterolu v krvi o 10 %.
Sérum – stabilita vzorku: 18 – 26 °C: 1 den, 2 – 8 °C: 7 dní, -20 °C: 12 týdnů. Pokud je nutné vzorky
mrazit, tak pouze jednou. Stabilita při -60 °C je > 1 rok. Maximální čas od
získání do zpracování vzorku je 4 h při doporučené teplotě 20°C.
Plazma – stabilita vzorku: 18 – 26 °C: 3 h, 2 – 8 °C: 10
dní, -20 °C: 12 týdnů. Lze použít EDTA nebo heparin, ostatní protisrážlivá
činidla mohou být příčinou chyb. Pokyny k preanalytické úpravě vzorku:
Urychleně centrifugovat a separovat. Koncentrace v plazmě je asi o
3 % nižší jako v séru.
Stanovení ovlivňuje věk, dieta, pohlaví, menstruační cykly a má významný intraindividuální rozptyl. Po akutním onemocnění, po infarktu myokardu, po hospitalizaci je vhodné dodržet odstup až 3 měsíců.
Fyziologicky se koncentrace cholesterolu zvyšují během gravidity.
Nízké
koncentrace cholesterolu v séru (plazmě) mohou být důsledkem malnutrice,
malabsorpce, hypertyreózy.
Poznámky k analytické
metodě
Ke stanovení cholesterolu se používají v rutinní praxi enzymové metody. Estery cholesterolu jsou cholesterolesterázou převedeny na volný cholesterol a mastné kyseliny. Volný cholesterol je oxidován cholesteroloxidázou na cholestenon a peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku je stanovován fotometricky nebo fluorimetricky.
Liebermann–Burchardovy metody (kyseliny sírová + octová, acetanhydrid) byly v minulosti nejvíce využívány. Nebyly ale spolehlivé, protože výsledek závisel na předchozí dokonalém zmýdelnění esterů, např. digitoninem (estery jsou barevnější než volný cholesterol) a množství příměsí (7-dehydrocholesterol a α-7-cholesterol jsou 2x, resp. 4x barevnější).
Enzymová metoda se snadno
automatizuje. Největší výhodou je, že je možné se vyhnout používání agresivních
činidel a interference jsou významně snížené použitím specifických enzymů. Lze
stanovit zvlášť volný cholesterol a esterifikovaný pak dopočítat. Jestliže se
v soupravě používá chinoniminové barvivo, je nutné splnit několik
podmínek. Měření blanku je problematické u zakalených vzorků. Pokud se
používají plastové kyvety, barvivo se do nich pomalu absorbuje a opakované
používaní je nevhodné. Ve skleněných kyvetách k absorpci nedochází.
Trinderovu reakci lze měřit v intervalu 460 až 560 nm (500 nm je maximum) a běžně se používá 505,
Pro cholesterol je v současné době uznávaná jako definitivní metoda (dle nejnovější metrologické terminologie referenční metoda) izotopová diluce s hmotnostní spektrometrii ID-MS), vyvinutá Národním institutem pro standardy a technologie (NIST). ID-MS poskytuje výsledky, které nezávisí na výtěžnosti vzorku a mohou být testovány na vychýlení. ID-MS je založena na přidávání známého množství značeného analytu, který slouží jako vnitřní standard – je to [13C3]cholesterol. Značený analyt je v rovnováze z endogenním analytem ze vzorku a pak měříme poměr neznačeného a značeného analytu plynou chromatografii s hmotnostním detektorem.
Referenční metodou je Abell-Levy-Brodie-Kendallova (ALBK) metoda po úpravě Centrem pro kontrolu nemocí (CDC) a vychází se z původní Liebermann- Buchardovy metody. Cholesterol je extrahován zeolitem (původní extrakce do éteru nebo směsi etanol + éter), estery jsou alkalicky zmýdelněny a celkový cholesterol je měřen po Liebermann–Burchardově reakci.
Definitivní metoda má CV < 0,5 % a celkovou nejistotu < 1 %. ALBK metoda umožňuje dosáhnout CV < 1.5% v sérii a < 3% mezi laboratořemi a po optimalizaci dokonce <1%. Referenční metoda dává výsledky o 1,6 % vyšší než metoda definitivní a průměrnou výtěžnost 100,5 %.
Metody ke stanovení cholesterolu jsou dobře standardizovány, enzymové metody vykazují mezidenní reprodukovatelnost CV 5 %. Jsou-li kalibrátory, reagencie a přístroje od stejného výrovce, lze dosáhnout CV 1,5 – 2,5 %.
Referenční materiály NIST jsou: lyofilizované lidské sérum SRM 909, cholesterol o čistotě 99,8±0,1 % jako SRM 911a a SRM 911b.
Intraindividuální variace je 6 %, interindividuální variace 14,9 %, vychýlení 4 %, celková chyba 9 %. Požadavky National Cholesterol Education Program (NCEP) – Lipid Standardization Panel pro klinickou interpretaci (2004) jsou: vychýlení ≤ 3 %, CV ≤ 3 %, SEKK uvádí limity +10%, resp. -15% od referenční hodnoty.
Interference
Koncentraci cholesterolu snižují: acylpyrin (velká dávka), anopyrin (velká dávka), bilirubin (inhibuje enzymové reakce), celková bílkovina (> 100 g/l), citronan, cvičení (1 h a více), česnek, dehydroepiandrosteron, dusitany, estradiol, fluoridy, framykoin, gasterin, glukagon, hemodialýza, hemoglobin, heroin, IGF-1, interleukiny 3 a 6, inzulín, kyseliny askorbová a nikotinová, lipémie (vysoká), α-metyldopa, orotát draselný, oxaláty, pektin, peritoneální dialýza, premenstruace, pyridoxin, sitostanol, stres, těhotenství (1. trimestr), thyreotom, triacylglyceroly (> 9 mmol/l) aj.
Koncentraci cholesterolu zvyšují: adrenalin, acylpyrin (běžná dávka), anopyrin (běžná dávka), cyklosporin, etanol, fruktóza, GH, chlorpromazin, káva, kreatinin (0,5 % na 970 µmol/l), kyselina močová (1,6 % na 2,95 mol/l), menopauza, noradrenalin, plegomazin, slepota, těhotenství (5. – 7. měsíc), trimecryton, tryptofan, urandil aj.
Další informace
Postupy pro hodnocení aktivit enzymů
Postupy pro hodnocení koncentrací proteinů
Postupy pro hodnocení koncentrací léků
a drog
Postupy pro hodnocení koncentrací
lipidů
Petr Štern, 2010-03-10