Stanovení glukózy
Synonyma
glukosa, dextróza, dextrosa,
hroznový cukr, škrobový cukr
D-glukosa, D-glukóza
Preanalytická
fáze
Přednost se dává
stanovení v plazmě nebo plné krvi. Při
odběru krve je nutný přídavek antiglykolytické přísady (NaF), jako
antikoagulant se používá K2EDTA, heparin, oxalát nebo
citronan. Vzorek odstředit do 60 min
od náběru. Při použití plné krve na
stanovení glukometrem je nutná okamžitá analýza, protože nelze přidávat NaF.
V plné krvi bez antiglykolytické přísady dochází při laboratorní teplotě k
úbytku glukózy až o 5 – 7 % za hodinu. Při stabilizaci antiglykolytickou
přísadou také dochází k poklesu koncentrace glukózy, tento pokles je však
způsoben neenzymovou glykací proteinové matrice: enzymové metody stanovují
pouze volnou glukózu, nikoli glukózu vázanou kovalentně na proteiny.
Koncentrace glukózy v plné
krvi je nižší než koncentrace v plazmě, vysoké rozdíly jsou u novorozenců.
Průměrný rozdíl hodnot je 10 až 15 % (kolísá v rozsahu 4 až 47 %). Rozdíl
koncentrace glukózy mezi kapilární a venózní krví je nalačno 5 %,
postprandiálně 10 až 15 % (vyšší koncentrace je v kapilární krvi), u
postprandiálních a oGTT vzorků však byly pozorovány rozdíly až 50 %. Hodnoty
v arteriální krvi jsou nalačno o 5 až 10 % vyšší než v krvi venózní.
Stanovení v séru bez antiglykolytické přísady má značná
omezení daná sníženou stabilitou vzorku. Maximální čas od získání do zpracování
vzorku je 1 h při doporučené teplotě 20°C.
Stabilita koncentrace glukózy v séru i plazmě,
oddělených od elementů separačním gelem je minimálně 24 h při 8 °C i při
laboratorní teplotě. Sterilní vzorek 24 h při 25 °C, 72 h při 4 °C.
Stabilita vzorku (plazma): 18 – 26 °C: 24 h, 2 – 8 °C: 7
dní, -20 °C: 6 – 12 měsíců.
Hemolýza má na výsledek jen malý
vliv, hemoglobin neruší do koncentrace 1,0 g/l; silnější hemolýza zvyšuje
výsledek při použití glukózaoxidázové metodě bez deproteinace (při použití
deproteinace hemolytického vzorku naopak snižuje). Postupy, které používají
odbílkování, se získávají hodnoty koncentrace glukózy vyšší (o 5 %
v plazmě, o 10 % v plné krvi) než u metod bez deproteinace.
Glukóza se stanovuje také ve sbírané moči (za 6, 8, 12
nebo 24 h). Při sběru moče zabraňte bakteriální kontaminaci (kyselina octová).
Stabilita vzorku: 2 – 8 °C: 24 h, -20 °C 2 dny.
Pokud se stanovení provádí v rámci základního
chemického vyšetření moče, je maximální čas od získání do zpracování vzorku 2 h
při doporučené teplotě 22° C. Stabilita vzorku: 18 – 26 °C: 2 h.
Při stanovení glukózy v likvoru zabraňte jakékoli
bakteriální kontaminaci. Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 1 h
při doporučené teplotě 20°C, 3 h při transportu na tajícím ledu. Avšak uváděná
stabilita vzorku je delší; při 18 – 26 °C: 5 h, 2 – 8 °C: 3 dny, -20 °C: 12
týdnů.
Vzácně se stanovuje také glukóza v drénu, pleurální nebo peritoneální tekutině.
Poznámky k
analytické metodě
Klasické fotometrické metody stanovení
glukózy byly buď nespecifické nebo vyžadovaly zahřívání, které
v automatických analyzátorech není možné a proto byly zcela opuštěny.
Spektrofotometrie:
Stanovení s glukózaoxidázou (GOD) a peroxidázou (POD) a
oxidační kopulací je v praxi nejrozšířenější. Principem je oxidace glukózy
na D-glukonolakton a peroxid vodíku, který se využívá buď k oxidaci
některých leukobází (aromatické diaminy typu o-tolidin, o-dianisidin, aj.),
nebo častěji k oxidační kopulaci 4‑aminoantipyrinu (AAP) s fenolem
na chinoniminové barvivo, které se měří při 500 nm. Reakci ruší redukující
látky, avšak vzhledem k poměrně vysoké koncentraci glukózy v plazmě
endogenní vitamin C neruší. Reakci inhibují také kyselina močová, bilirubin
(inhibice se sníží přídavkem ferokyanidu draselného), hemoglobin, tetracyklin,
glutation. Preciznost CV 2 – 9,7 %.
Při stanovení
katalyzovaném hexokinázou vzniká s ATP glukóza-6-fosfát, který
se glukóza-6-fosfátdehydrogenázou oxiduje na 6-fosfoglukonát při současné
redukci NADP+ nebo NAD+. Měří se absorbance NADPH nebo
specifičtějšího NADH při 340 nm, kdy neinterferuje
glukóza-6-fosfátdehydrogenáza z erytrocytů. Reakce je vysoce specifická a
používá ji většina laboratoří v USA. Preciznost CV 2 – 10 %. Tento postup je
všeobecně akceptovaný jako běžná referenční metoda (ovšem s deproteinací
Ba(OH)2 a ZnSO4). Reakci lze převést i do viditelné
oblasti, když NADPH dále reaguje s fenazinmetosulfátem a substituovanou
tetrazoliovou solí, např. 2-(p-jódfenyl)-3-p-nitrofenyl-5-fenyltetrazoliumchloridem
za vzniku zbarvení měřeného při 520 nm.
Metoda při níž se glukóza oxiduje glukózadehydrogenázou
za současné redukce NAD+ na NADH se u nás nepoužívá. Preciznost
v sérii CV 1,12 – 2,45 %, mezi sériemi 1,93 – 4,0 %.
Reflexní fotometrie: Na principu GOD-POD reakce pracují
glukometry: komponenty reakce jsou součástí reakční zóny proužku (celulózová
nebo skleněná vlákna nebo želatinový film); po aplikaci krve dochází
k produkci barevné látky a intenzita zbarvení se měří reflexní fotometrií.
Ampérometrické měření vychází z oxidace
glukózy katalyzované GOD (zakotvená na pryskyřici), kdy se kyslík redukuje na
peroxid vodíku a jeho úbytek se stanovuje Clarkovou elektrodou. Peroxid vodíku
přitom difunduje přes membránu z acetátu celulózy a oxiduje se zpět na platinové
anodě (uvolňují se elektrony). Na stříbrné katodě pak dochází k jeho
redukci na vodu. Preciznost CV 2,8 – 6,3 %.
Transdermální stanovení reverzní iontoforézou využívá
ultrazvuku k uvolnění intersticiální tekutiny ve které se pak stanoví
glukóza např. ampérometricky. Postup není považovaný za dostatečně spolehlivý.
Semikvantitativně v moči:
Principem vyšetření je kombinace
dvou enzymů a indikátoru na nylonových vláknech detekční zóny. Jde o použití
spřažené reakce glukózaoxidázy a peroxidázy, kde přenosem vzniklého peroxidu se
mění žlutá barva chromogenu na červenohnědou nebo modrou.
TLC průkaz v moči se považuje za obsoletní.
Referenční metoda ID-GC/MS:
Ke vzorku se přidá známé množství
glukosy, značené uhlíkem
Certifikovaný referenční materiál
nese označení SRM
Toleranční limit EHK: plazma, sérum
10 %, moč 22 %, likvor 18 %.
Vnitřní kontrola kvality CV: 3,3 %
(NCEP, USA: 3,0 %)
Teoretický toleranční limit: 7 %
Interference
Koncentraci glukózy v séru snižují:
acetoacetát, alanin, Ascorutin, bilirubin, cibule, cystein, cystin, estradiol,
etanol, fibrin, galanin, IGF-1, inderal, inzulín, kreatinin > 2200 µmol/l,
kyselina gentisová, kyselina močová, NaF > 20 mg/l, močovina > 20 mmol/l,
oxalát, Phenergane, proinzulín, Prothazin, tetracyklin, trimepranol, vitamin C,
aj.
Koncentraci
glukózy v séru zvyšují: adrenalin, arginin, citronan, celková bílkovina
> 100 g/l + 5 až 6 %, Corinfar, cyklosporin, Desurol, dexametason, dolsin,
dopamin, edecrin, EDTA, endorfin, Euspiran, fenylbutazon, fruktóza, Furanthril,
Furantral, furosemid, galaktóza, Gasterin, glukagon, glutation, gravidita,
hemolýza, hydrochlorothiazid, Hyperstat, chlorpromazin, isoprenalin, káva,
kyselina glukuronová, kyselina homogentisová 10 mmol/l +51,8 %, 1 mmol/l +6,2
%, kyselina nikotinová +16 %, laktóza, Nalidixin, nenasycené mastné kyseliny,
noradrenalin, Nutramin, manóza, plegomazin, ribóza, růstový hormon, Sodanton,
Spasmoveralgin, tensamin, thyreoidin, triacylglyceridy > 5,1 mmol/l,
Trimecryton, tyramin, Urandil, xylóza, aj.
Koncentraci
glukózy v moči snižují: acetoacetát, acylpyrin, Amoclen, ampicilin,
anopyrin, Ascorutin, bakteriurie, bilirubin, diazepam, formaldehyd, kyselina
gentisová, kyselina chlorovodíková, kyselina octová, kyselina homogentisová,
kyselina 5-hydroxyindoloctová, kyselina močová, Rhytmochin, Rudotel, Seduxen,
spasmoveralgin, tetracyklin, vitamin C, aj.
Koncentraci
glukózy v moči zvyšují: adrenalin, Borocon, Desurol, dexametason,
fenobarbital, Fentanyl, fruktóza,
Furanthril, Furantral, furosemid, glukagon, gravidita,
hydrochlorothiazid, chloramfenikol, chlorpromazin, kyselina acetoctová,
laktóza, morfin, Nalidixin, noradrenalin, oxazepam, pendepon, penicilin,
peroxid vodíku, plegomazin, streptomycin, tetracyklin, aj.
Další informace
Petr Štern, 2010-07-22