Stanovení hemoglobinu
A1c (glykovaného hemoglobinu)
Synonyma
glykohemoglobin,
glykosylovaný hemoglobin
GHb,
HbA1c, HbA1c
Preanalytická fáze
Odběr
nalačno. Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 4 h při doporučené
teplotě 20°C. Pro stanovení v krvi (hemolyzátu)
je možné použít EDTA nebo heparin.
Stabilita je 2 – 3 dny při +18 až + 26 °C, 5 – 7 dní při +2
až +8 °C a 6 měsíců při -20 °C, ale dle možnosti nezamrazovat.
Poznámky k analytické metodě
K dispozici
je více než 30 metod ke stanovení glykovaného hemoglobinu. Metody jsou založené
na separačních postupech nebo rozdělování podle náboje, nebo kombinaci obou
postupů. Jedná se o iontově-výměnnou chromatografii na mikrokolonách nebo
minikolonách, HPLC, afinitní chromatografii na minikolonách, elektroforézu a
izoelektrickou fokusaci.
Iontově-výměnná
chromatografie je založena na tom, že glykované A1
hemoglobiny jsou při neutrálním pH méně kladně nabité než HbA0,
takže mají slabší vazbu na negativně nabitou pryskyřici a jsou eluovány dříve.
Používají se dva pufry, první eluuje frakce A1a a A1b,
druhý pak frakci A1c. HbA0 se neeluuje, ale stanoví jako
celkový hemoglobin fotometricky. Komerčně jsou dostupné i kolony na jedno
použití. Metoda je citlivá na dodržování teploty. Preciznost CV 7,2 – 32,4 %.
Metodu nelze použít u nemocných s β-talasemií nebo při vrozeném
přežívání HbF (falešně zvýšené výsledky).
Afinitní
chromatografie dosahuje separace celkového glykovaného
hemoglobinu, tj. včetně α-řetězce a glykovaného lysinového konce, pomocí
kolony s boronovou kyselinou. Glykované hemoglobiny se na ni navazují
svými cis-diolovými skupinami (vzniká pětičlenný kruh). Neglykované hemoglobiny
jsou eluované jako první. Následně jsou glykované hemoglobiny (mimo A1a
a A1b) z boronátové vazby vytlačeny sorbitolem a eluovány.
Jednotlivé frakce jsou sledovány fotometricky. K dispozici jsou komerčně
připravené kolony pro POCT. Výsledky jsou proti ostatním metodám trochu vyšší.
Preciznost CV 3,7 – 15,2 %. Výsledky nejsou ovlivněny karbamylovaným nebo
acetylovaným Hb, dalšími variantami Hb, β-talasémii a vrozeným vyšším HbF.
Interferuje vysoká lipémie. Vliv teploty je menší než u iontově-výměnné
chromatografie.
Afinitní
chromatografie může k detekci použít také hmotnostního spektrometru
s ionizací kapalné fáze elektrosprejem.
HPLC je rychlá a
přesná metoda, která je považována za referenční. Hemolyzát se nastřikuje na
kolonu s katexovou pryskyřicí. Pufry se stoupající iontovou silou
procházejí kolonou a jednotlivé eluované frakce se monitorují. Pro standardizaci
byl navržen univerzální kalibrátor. Preciznost CV 7,1 – 11,3 %.
Elektroforetická
separace HbA1 se provádí v hemolyzátu na
agaru. Využívá se schopnosti volných N-koncových skupin neglykovaného
hemoglobinu reagovat s nabitými skupinami jako jsou sírany z agaru
nebo pufru. V kyselém pH neglykovaný hemoglobin putuje k anodě,
většina glykovaných hemoglobinů ke katodě a frakce A1c zůstává na
aplikačním bodu. Hemoglobinové pruhy se vyhodnocují denzitometrem. Preciznost
CV 3,7–11,3 %
K dispozici
jsou komerční soupravy pro separaci HbA1 a HbA1c
(interferuje karbamylovaný a acetylovaný Hb) od HbA0 (interferuje
HbE0 a HbE1c) umožňující přímou vizualizaci jednotlivých
frakcí. Interference lze omezit hemolyzačním činidlem a elektroforéza nezávisí
na teplotě.
Izoelektrická
fokusace: Varianty hemoglobinu se dělí na základě jejich
rozdílné migrace v polyakrylamidovém gelu s gradientem pH 6 – 8.
Současně lze analyzovat až 35 vzorků, které se pak hodnotí densitometrem.
Imunochemické
metody detekují HbA1c pomocí monoklonálních
nebo polyklonálních protilátek rozeznávajících aminokyseliny na amino-konci
β-řetězce nebo glukózový zbytek, případně obojí (ovčí polyklonální Ab).
Hodnotí se poměr HbA1c k celkovému hemoglobinu stanovenému
fotometricky. Dostupné jsou metody na
principu enzymové imunoanalýzy, automatizované latexové imunoaglutinační
inhibice (LIAI) a automatizované turbidimetrické inhibiční imunoanalýzy
(TINIA). Předpokládá se interference některých hemoglobinových variant.
Preciznost CV 2,3 – 5,3 %. Některé imunoanalýzy jsou použitelné pro POCT.
Toleranční limit EHK: 20 %.
Interference
Koncentraci HbA1c v krvi
(hemolyzátu) snižují: anémie, gravidita, hemoglobin C, hemoglobin S.
Koncentraci HbA1c v krvi (hemolyzátu)
zvyšují: varianty hemoglobinu (acetylovaný Hb, karbamylovaný Hb), hemoglobin F.
Další informace
Petr Štern, 2010-07-22