Stanovení TSH
(tyreotropinu)
Synonyma
Thyreotropní hormon,
thyreotropin, thyreostimulační hormon, TSH
Preanalytická fáze
Protože sekrece TSH je stejnoměrná po celý den, lze získat validní
klinickou informaci ze vzorku krve odebraného kdykoliv. Jinde se doporučuje
odběr ráno a nalačno, vzhledem k diurnálnímu rytmu. Jako vzorek lze použít
plazmu (antikoagulans heparin) nebo sérum, ale výrobci některých souprav
doporučují analyzovat pouze sérum. Použití EDTA v plazmě může vést
k falešně vyšším výsledkům. Žádné rozdíly ve výsledcích se neprojevily
mezi vzorky při použití nebo bez použití separačního gelu. Pro novorozenecký
screening se odebírá krev 48 – 72 h po narození.
Ačkoliv
je TSH v séru stabilní alespoň 5 dní při 4 °C, mělo by se sérum zamrazit
při -20 °C, pokud se analýza neprovede do 24 h. Jinde se uvádí maximální čas od
získání do zpracování vzorku 4 h při doporučené teplotě 20°C. Stabilita vzorku:
18 – 26 °C: 24 h, 2 – 8 °C: 3 – 5 dnů, -20 °C: 3 měsíce. Po úplném rozmrazení
by měly být vzorky promíchány před analýzou, aby se zajistila jejich úplná
homogenita.
Opakované zamrazování vzorků se nedoporučuje. Biologický poločas
TSH je 54 min.
Silná hemolýza a lipémie při analýze ruší, ale mírná hemolýza nebo
lipémie při většině metod nevadí. Významnou interferenci způsobují heterofilní
a lidské protilátky vůči myším protilátkám (HAMA).
Protože imunologická aktivita TSH vykazuje antigenní specifitu,
nelze použít analytické soupravy pro lidské TSH k měření koncentrací TSH
v krvi zvířat.
Poznámky k analytické
metodě
Termíny jako citlivý, ultrasenzitivní, supersenzitivní,
vysoce citlivý jsou výrobci analytických souprav používány k propagaci
jejich nových TSH testů. Tato adjektiva přitahují pozornost k novým TSH
soupravám, ale také vytvářejí mnoho nedorozumění co se týká jejich přesného
významu. Třídění TSH podle generací je založeno na představě, že každá generace
představuje desetinásobné zdokonalení funkční citlivosti, což by mělo
jednoznačně vysvětlit dosud zmatečnou terminologii. První generace TSH souprav
byly běžné RIA s funkční citlivostí 1 – 2 mU/l a byla použitelná pouze
k rozlišení hypothyreoidismu a euthyreoidismu. Imunometrické testy TSH
druhé generace detekovaly 0,1 – 0,2 mU/l a mohly rozlišit nejen
hypothyreoidismus, ale také hyperthyreoidismus od euthyreoidismu. Třetí
generace vykazuje funkční citlivost 0,01 – 0,02 mU/l a kromě diagnózy obou
poruch umožňuje také zjistit závažnost hyperthyreoidismu. Čtvrtá generace má
citlivost 0,001 – 0,002 mU/l.
Výrobci imunoanalytických souprav pro stanovení TSH obvykle vyjadřují
detekční limit jako zdánlivou koncentraci TSH, odpovídající dvěma směrodatným
odchylkám nad signálem pro nulový kalibrátor (tj. analytická citlivost). Tento
analytický limit ale nemusí odpovídat výsledkům měření vzorků, provedených jiný
den a s odlišnou šarží činidel. Proto bylo navrženo používat ke třídění
TSH souprav funkční citlivost (tj. nejnižší koncentraci TSH s CV mezi
soupravami 20 %).
Jak analytická, tak funkční citlivost jsou založeny na statistické
extrapolaci dat a nikoliv na skutečném měření nejmenšího stanovitelného
množství TSH. Analytická citlivost je nejmenší signál, který lze statisticky
rozlišit od signálu matrice používané při analytické metodě; lze si představit,
že tento signál může být překročen interferujícími látkami a TSH přítomným ve
vzorku, ale nikoliv samotnou matricí analytické soupravy. Byla doporučena
také technika opakovaného ředění vzorku a největší ředění, kdy ještě bylo
dosaženo CV ±20 % představovalo nejnižší stanovitelnou koncentraci. Pro TSH
druhé generace je tato koncentrace 0,10 – 0,65 mU/l.
Typické pro stanovení TSH jsou neizotopové imunoanalýzy na principu EIA,
FIA a LIA. Další postupy, jako radioimunoanalýza a cytochemická analýza mají
jen okrajové využití.
Radioimunoanalýza měří imunologickou aktivitu,
nikoliv biologickou aktivitu cirkulujícího TSH, ačkoliv jsou výsledky tradičně
vyjadřovány jako biologická aktivita v mU/l séra. Přitom je možné, že TSH
molekula ztratí svou biologickou aktivitu, aniž ztratí imunologickou aktivitu.
Nicméně dostupná data ukazují, že měření koncentrace TSH RIA dobře koreluje
s biologickou aktivitou. Rutinní stanovení TSH se začalo provádět teprve
až byl k dispozici purifikovaný TSH z hypofýzy a bylo možné připravit
protilátky. Hormon byl k dispozici také k radioaktivnímu značení a
jako standard. Detekční limit většiny RIA metod je kolem 1 mU/l, což není
dostatečné pro měření TSH ve zdravé populaci. Proto byla kompetitivní RIA (TSH
ze vzorku soutěžil s TSH značeným 125I o omezený počet
vazebných míst na protilátce) nahrazena
citlivějšími nekompetitivními imunometrickými analýzami.
Nekompetitivní sendvičová IRMA na pevné fázi používá kotvící myší
monoklonální protilátku vůči TSH a signální polyklonální kozí protilátku
značenou 125I vůči odlišnému epitopu TSH. Obě protilátky jsou
v přebytku a navzájem spolu nereagují. Vzniklý imunokomplex se oddělí,
promyje a měří. Radioaktivita je přímo úměrná koncentraci TSH ve vzorku.
Kalibrační rozsah 0,15 – 60 mU/l, analytická citlivost 0,03 mU/l.
Reprodukovatelnost v sérii má CV 1,9 – 5,8 %, mezi sériemi 3,4 – 9,0 %;
výtěžnost 90 – 108 %. Také tento postup se používá omezeně. Podle průzkumu College of American Pathologists 99 %
laboratoří už v roce 2001 používalo neizotopové postupy.
ELISA používá sendvičové
uspořádání. Zkumavka je potažena streptavidinem, který váže 4 molekuly biotinu.
Na kotvící protilátku je připojen biotin. Křenová peroxidáza se používá jako
značka signální protilátky. Poté co se TSH oběma vazebnými epitopy váže na
protilátky se imunokomplex promyje a přidá se chromogenní substrát ke stanovení
aktivity POD. Díky přebytku vazebných míst streptavidinu se zlepšuje preciznost
a citlivost metody.
ELISA může použít také mikrotitrační jamky přímo potažené monoklonální protilátkou
vůči TSH. Po přidání vzorku se pipetuje druhá polyklonální protilátka vůči TSH,
značená křenovou peroxidázou a po inkubaci tetrametylbenzidin a peroxid
vodíku jako substráty. Reakce se zastavuje ředěnou 1M kyselinou sírovou a měří
se absorbance při 450 nm. Měřící rozsah 0,2 – 40 mU/l, citlivost 0,2 mU/l. Jiný
výrobce 0,1 – 30 mU/l.
Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,9 – 6,4 %, mezi sériemi 7,0 –
8,42 %; výtěžnost 92 – 109 %, linearita 85 – 105 % . Efekt nadbytku antigenu
nebyl pozorován do 2000 mU/l.
Podobný princip vazby jako streptavidin-biotin je mezi fluorescein
izothiokyanátem (FITC) a vysoce imunogenní skupinou protilátky vůči FITC, která
je vázána na magnetické částice.
Protilátka vůči TSH s navázaným FITC a značená ALP je inkubována se
sérem. Pak se přidají magnetické částice potažené anti-FITC a tím se umožní
oddělení nadbytečné protilátky vůči TSH, značené ALP, v magnetické poli,
zatímco imunokomplex rychle sedimentuje. Imunoreakce u této metody probíhá
v kapalné fázi, ale difúze a geometrické usměrnění se děje na pevné fázi.
Imunoreakce je jednostupňová a zkracuje se reakční čas.
Reakce může proběhnout také jako klasická imunoenzymometrická analýza
(IEMA) se signální protilátkou značenou ALP.
FIA používá magnetické nebo
latexové mikrokuličky potažené monoklonální protilátkou vůči TSH, značkou je
ALP a substrátem 4-metylumbeliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm
(excitace při 365 nm).
MEIA používá dvě protilátky vůči
TSH, z nichž jedna je zakotvena na latexové mikrokuličky o průměru 0,47 µm
a druhá protilátka vůči jinému epitopu TSH je značená ALP. Vzniklý imunokomplex
je oddělen na skleněné fritě a po promytí reaguje s 4‑metylumbeliferylfosfátem a měří se intenzita fluorescence vznikajícího
4‑metylumbeliferonu při 450 nm. Koncentrace TSH je přímo úměrná intenzitě
fluorescence (tj. aktivitě ALP). Přitom nebyla prokázána žádná křížová
reaktivita hCG, FSH nebo LH. Citlivost metody je 0,02 mU/l. Reprodukovatelnost
v sérii má CV 5,1 – 8,8 %.
Protilátka vůči TSH může být také zakotvena na magnetických kuličkách a
imunokomplex separován magnetem. Obě metody se používají na automatických
analyzátorech.
Imunofluorimetrická analýza (IFMA, DELFIA) využívá protilátku vůči
TSH označenou chelátem europia a fluorescenci rozloženou v čase jako
detekční metodu. U většiny fluorescenčních imunoanalýz se setkáváme
s vysokým signálem pozadí a v důsledku toho s nízkou citlivostí.
Aby se zamezilo vysokému pozadí, jsou vzorky obvykle před fluorescenční
imunoanalýzou upraveny. Chelát europia má mnohem delší poločas rozpadu (10-3
až 10-6 s), než je běžně emitovaná fluorescence sloučenin
způsobujících fluorescenční pozadí (10-8 až 10-9 s),
takže tato specifická fluorescence se může měřit po vymizení signálu pozadí.
Při této metodě se používají dvě protilátky vůči odlišným epitopům
β-podjednotky TSH; jedna monoklonální protilátka je označena
nefluoreskujícím chelátem europia a druhá je zakotvena na mikrotitrační
destičce. Provede se inkubace séra s oběma protilátkami při laboratorní
teplotě; jamky se poté odsají a promyjí, aby se odstranila nenavázaná signální
protilátka. Fluorescence europiového iontu se projeví teprve po jeho disociaci,
ke které dochází prostřednictvím zesilovacího roztoku obsahujícího ligandy
absorbující energii, jež jsou vyžadovány pro vznik fluoreskujícího chelátu
(tri-n-oktylfosfinoxid a 2-naftoyltrifluoraceton). Emise světla europiového
iontu je měřena fluorimetrem po dobu 400 ms. Touto technikou lze měřit
koncentrace 10-14 M a teoreticky lze citlivost ještě zvýšit, protože
na molekulu protilátky se může připojit několik iontů europia. Postup může být
částečně nebo úplně automatizovaný. Rozsah měření 0,005 – 100 mU/l.
Reprodukovatelnost v sérii má CV 1,9 – 6,7 %, mezi sériemi 5,0 – 5,9 %.
Luminiscenční imunoanalýza používá buď luminogen
jako značku nebo jako substrát. Takovým substrátem je dioxetanfenylfosfát,
který je štěpen ALP ze signální protilátky. Tato protilátka je zakotvena na
paramagnetických částicích (magnetická separace) nebo polystyrénových kuličkách
(separace centrifugací v podélné ose).
Imunoluminometrická
analýza (ILMA) je založena na nekompetitivní vazbě TSH na
přebytek protilátky označené esterem akridinu. Metoda je plně automatizovaná a
může prokázat až 0,04 mU/l TSH. Extrémně vysoká citlivost metody je dosažena
díky značce, která vykazuje intenzivní luminiscenci. ILMA využívá oba epitopy
TSH. Kotvící monoklonální kozí protilátka proti prvnímu epitopu je v prostředí
pufru HEPES (N-2-hydroxyetylpiperazin-N´-etansulfonová kyselina), obsahujícího hovězí sérový albumin,
kovalentně vázána na ester akridinu. Současně je na druhý epitop TSH připojen
na kozí monoklonální protilátku proti myšímu IgG s navázaným
fluoresceinizothiokyanátem (FITC). Následně se přidává kozí monoklonální
protilátka proti FITC, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice
niklu. Po odstranění nemagnetického materiálu odsátím a promytím se přidá
alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný
luminometrem. Intenzita luminiscence je přímo úměrná množství TSH ve vzorku. Linearita:
do 150 mU/l, detekční limit: 0,001 mU/l (2 SD), funkční citlivost: 0,008 mU/l
(CV £ 20 %),
reprodukovatelnost v sérii CV 1,44 – 2,85 %, v čase 0,88 – 2,35 %,
výtěžnost: 91 – 108,3 %. Efekt nadbytku
antigenu se do 2000 mU/l neprojevuje.
LIA
stanovení s využitím volného substrátu je založeno na
sendvičové imunochemické reakci. TSH se v prostředí pufrovaného roztoku jedním
epitopem váže na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrénové
kuličce a druhým epitopem reaguje s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou
s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění
nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje
luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci TSH ve vyšetřovaném
vzorku. Linearita: do 75 mU/l, detekční limit 0,01 mU/l (2 SD), funkční
citlivost 0,01 mU/l (CV £ 20 %);
reprodukovatelnost v sérii pro 0,13 mU/l CV < 7,8 %, v čase pro 0,13
mU/l CV < 12,4 %;
výtěžnost: 97 – 111 %. Efekt nadbytku antigenu se do
7200 mU/l neprojevuje.
ALP
může reagovat i s jiným luminiscenčním činidlem, např. Lumi-Phos 530. Zkumavky jsou potažené konjugátem kozí
polyklonální TSH protilátky s ALP, do nich se pipetuje vzorek a přidají se
paramagnetické částice potažené monoklonální myší protilátkou vůči TSH
v pufru TRIS s hovězím albuminem. Po separaci v magnetickém poli
se promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát.
Rozsah měření při 470 nm je 0,01 – 100 mU/l. Analytická citlivost 0,003 mU/l (2
SD), funkční citlivost 0,01 – 0,02 mU/l (CV £ 20 %). Reprodukovatelnost v jednotlivých
sériích měla CV 3,5 – 8,5 %.
Homogenní
chemiluminiscenční imunoanalýza
(LOCI) je založena na sendvičovém principu. Dvě činidla jsou zakotvena na
kuličkách a dále je v reakci použitý biotinylovaný fragment monoklonální
protilátky vůči TSH. První kulička (Sensibeads) je potažena streptavidinem a
obsahuje barvivo citlivé na světlo. Druhá kulička (Chemibeads) je potažena
druhou monoklonální protilátkou a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Vzorek
je inkubován s biotinylovanou protilátkou a druhou kuličkou
s protilátkou značenou chemiluminiscenčním barvivem. Ke vzniklému sendviči
se přidá první kulička potažená streptavidinem a vznikne imunokomplex se dvěma
kuličkami. Ozářením imunokomplexu světlem 680 nm vzniká na fotocitlivém barvivu
singletový kyslík, který difunduje do chemiluminiscenčního barviva a spouští
chemiluminiscenční reakci. Generované světlo se měří při 612 nm a je přímo
úměrné koncentraci TSH ve vzorku. Analytická i funkční senzitivita byly 0,005
mU/l. Reprodukovatelnost v sérii je CV 1,47 – 1,76 %, mezi sériemi 2,30 –
3,06 %; výtěžnost: 100 – 104 %. Efekt nadbytku antigenu se do 30000 mU/l
neprojevuje.
Elektrochemiluminiscence následuje po
imunoreakci na sendvičovém principu, kdy se vzorek inkubuje s biotinylovanou
monoklonální protilátkou, specifickou vůči TSH a monoklonální protilátkou,
specifickou vůči TSH značenou ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový
imunokomplex. Přidají se mikročástice potažené streptavidinem, na který se
naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící
komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody.
Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí
na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Metoda je
použitelná v rozsahu 0,005 – 100 mU/l (po ředění 10x do 1000 mU/l).
Detekční limit je 0,005 mU/l (2 SD), funkční citlivost 0,014 mU/l (CV £ 20 %). Reprodukovatelnost v sérii CV 1,2 –
8,6 %, mezi sériemi 1,8 – 8,7 %.
Cytochemická
analýza je nejcitlivější metodou pro stanovení TSH. Tak
lze prokázat 50 nU/l TSH, což je 104x citlivější než běžné imunoanalýzy. Metoda
ale vyžaduje zařízení pro tkáňovou kultivaci, kryostatické řezy,
mikrodenzitometrické snímání a je velmi pracná, takže není vhodná pro rutinní
použití. Tato technika je založena na detekci vzrůstu propustnosti lysozomové
membrány buněk tyreoidálního folikulárního epitelu pro chromogenní substrát,
která je vyvolána TSH. Segmenty tyroidní tkáně morčat jsou udržovány v kultivačním médiu neschopném proliferace a po určitou
dobu vystavené působení testovaného materiálu; poté jsou ochlazeny na -70 °C v
n-hexanu a řezány kryostatickým nožem. Jednotlivé řezy reagují
s chromogenním substrátem, leucyl-β-naftylamidem, který proniká přes lysozomální
membránu a reaguje s intralysozomální naftylamidázou. Markerem při této
metodě je tedy leucyl-β-naftylamid. Barevný reakční produkt vzniká
v každé folikulární buňce a měří se při 550 nm integrací snímaného
mikrodenzitometrického signálu. Koncentrace TSH v testovaném materiálu je
přímo úměrná absorbanci. Cytochemická analýza by mohla být pokládána za
referenční metodu, protože je nejcitlivějším postupem a měří biologickou
aktivitu TSH. Nicméně vyžaduje specializovanou techniku a je dostupná pouze ve
výzkumných centrech.
Řada
firem nabízí kvalitativní průkaz TSH jako důkaz primárního
hypothyreoidismu. Analýza je na imunochromatografickém principu. Sérum se
nakape do jamky v kazetě a přidá se protilátka vůči TSH, značená koloidním
zlatem. Pak se vzorek nechá vzlínat přes plochu kazety, na které je nanesena
kotvící protilátka vůči druhému epitopu TSH. Po 10 min se odečítá výsledek.
Koncentrace > 5 mU/l se projeví jako růžový proužek.
National
Institute for the Biological Standards and Control (NIBSC) poskytl jako WHO
referenční materiál ampule (označené
81/565), obsahující 2 µg TSH z hypofýzy, což odpovídá 11,5 mU ± CV 0,38 %.
Tento materiál byl schválen jako 3. mezinárodní standard pro TSH Expert Committee on Biological Standardization WHO
v listopadu 2003.
Data z USA 2001 uvádějí preciznost 4 – 8 % při koncentraci TSH 3 – 12
mU/l. Intraindividuální i interindividuální variace TSH jsou u zdravých
dospělých během 7 dnů přibližně 20 %. Analytická preciznost vzhledem
k biologické variaci by měla být 10 %.
Toleranční limit EHK: 14 %.
Interference
Koncentrace TSH v séru je snížena: acylpyrin, anopyrin, dopamin,
hemodialýza, ILGF-I, glukokortikoidy, hladovění, kouření, levedopa, pyridoxin,
těhotenství, Thyreotom, aj.
Koncentrace TSH v séru je zvýšena: ALP, amiodaron, cvičení, EDTA,
elektrošoky, heterofilní protilátky, jód, lidské
protilátky vůči myším protilátkám, lithium, menopauza, menstruace,
methimazol, monojódtyrosin, odvykání kouření, peritoneální dialýza, propylthiouracil,
stres, valproát, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-03