Stanovení tyroxinu
(T4)
Poznámka
Stanovení celkového T4 je opuštěno, význam má stanovení volné frakce T4
(free T4, fT4).
Synonyma
L-tyroxin, thyroxin, tonne, liothyronin,
T4
3,5,3´,5´-tetrajódtyronin
Preanalytická fáze
Při analýze se dává přednost séru. Plazmu lze také použít (antikoagulans
EDTA nebo heparin), ale po zamrazení a rozmrazení jeví sklon ke vzniku fibrinu
a může mechanicky interferovat zejména při analýzách na automatických
analyzátorech. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Nebyly pozorovány žádné
rozdíly při zpracování vzorku bez separačního gelu nebo se separačním gelem
(jiný pramen uvádí, že rozdíly pozorovány byly).
Stabilita vzorku: T4 je dosti stabilní, koncentrace se nemění ani
po 14 dnech za laboratorní teploty.
Nicméně se doporučuje sérum zamrazit, pokud se neanalyzuje do 24 h. Většina
souprav je určena pro stanovení T4 v séru nebo plazmě a nemůže být využita
ke stanovení v moči nebo likvoru, protože reakce antigenu
s protilátkou extrémně závisí na matrici měřeného vzorku.
Stabilita
v séru: 20 - 25 °C: 1 – 2 dny, 4 - 8 °C: 2 – 10 dní, -20 °C: 1 – 6 měsíců.
Výsledky ovlivňuje věk.
Biologický poločas v plazmě 5 – 8 dnů.
Hemolýza při analýze nevadí, ale je třeba se vyhnout silné
hemolýze, kdy by mohlo jejím vlivem docházet k naředění vzorku. Silně
lipemické vzorky by neměly být analyzovány, protože mastné kyseliny soutěží
s T4 o vazebná místa na TBG. Ojediněle se mohou projevit protilátky proti
fluoresceinu, které mohou způsobit falešně vysoké výsledky FPIA.
Při RIA je třeba, aby nebyly pacientovi podávány v rámci
terapie radionuklidy po dobu 14 dnů. Zvýšené autoprotilátky vůči T4 mohou
ovlivnit stanovení T4. Falešné zvýšení je u metod, kde dochází k vazbě
protilátek na pevnou fázi (naprostá většina metod) a ke snížení, vzniká-li
imunokomplex v roztoku (imunoseparace volné fáze na pryskyřici).
Poznámky k
analytické metodě
Metoda na principu kompetitivní vazby na proteiny
(competitive protein-binding assay CPBA) sleduje soutěž T4 ze séra a T4
značeného 125I o omezený počet vazebných míst na TBG. Protože je
99,97 % T4 vázáno na TBG a jiné bílkoviny, je třeba zajistit, aby bylo
konstantní množství TBG v každé zkumavce. To vyžaduje extrahovat T4 ze
vzorku etanolem a současně odstranit z něj TBG. To je časově náročné a
proto byla CPBA nahrazena automatizovanými imunoanalýzami (extrakce se obešla použitím blokačních činidel jako jsou
8-anilinonaftalensulfonová kyselina, salicylát sodný nebo thimerosal, tj.
merthiolát – kdy se selektivně blokuje vazba T4 na TBG, aniž se ovlivní
interakce T4 s protilátkou), kdy se jako markery používají 125I,
nebo mnohem více neizotopové značky jako enzymy, fluoreskující a luminiscenční
molekuly. Vyšší citlivost a specifita se dosahují použitím antiséra
s vysokou afinitou. Afinitní
konstanta může být 10-14 l/mol. Křížová reaktivita látek se
strukturou podobnou T4 je zanedbatelná. Již v roce 2001 měřilo 99 %
laboratoří v USA T4 neizotopovými metodami.
RIA je heterogenní postup,
vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu. Značkou je 125I.
Nejvíce se využívá separace na pevné fázi, kdy je protilátka vůči T4 vázaná na
pevnou podložku jako jsou skleněné kuličky, plastové zkumavky, celulóza nebo
magnetické částice. Lze také použít
druhé protilátky anebo polyetylenglykolu k vysrážení imunokomplexu. Běžný
detekční limit RIA je 5 nmol/l, ale proměření v dialyzátu se používají
citlivější postupy s detekčním limitem 2 nmol/l. Při koncentraci 49 nmol/l
je CV mezi sériemi ±7 %. Křížová reaktivita T3 při zastoupení 50 % byla 5 %.
Preciznost v sérii dosáhla CV 2,7 – 3,8 %, mezi sériemi 4,2 – 14,5 %.
Odezva na ředění 93 – 103 %.
Technika EMIT je homogenní enzymová imunoanalýza,
která nevyžaduje separační krok. Jako značka se používá
glukóza-6-fosfátdehydrogenáza kovalentně vázaná na T4. Enzym v konjugátu
je inaktivní po vazbě na specifickou protilátku vůči T4, pravděpodobně
v důsledku stérické zábrany. Takže množství konjugátu vázaného do
imunokomplexu je nepřímo úměrné enzymové aktivitě a může být měřeno bez
separace volného a vázaného T4. Enzymová aktivita je přímo úměrná množství T4,
přítomnému ve vzorku a stanovuje se oxidací glukóza-6-fosfátu zpraženou
s redukcí NAD+ na NADH.
Nevýhodou homogenní vůči heterogenní imunoanalýze je, že vzorek séra
často vyžaduje úpravu alkalizací, aby se eliminoval vliv vlastní sérové
enzymové aktivity na měření. Rozsah metody 6,4 – 309 nmol/l. Analytická
citlivost 6,4 nmol/l. Preciznost metody v sérii je CV 5,1 – 6,4 %, mezi
sériemi 7,7 – 11,6 %.
Metoda CEDIA je také homogenní enzymová imunoanalýza. Postup je
založený na vzniku aktivního enzymu ze dvou inaktivních fragmentů
β-galaktozidázy: enzymového donoru a enzymového akceptoru (získaného DNA
technologii). T4 je navázán kovalentně navázán na enzymový donor takovým
způsobem, že může docházet k samovolnému spojení donoru a akceptoru. Při
vzniku imunokomplexu donor-T4-protilátka je ale spojení donoru
s akceptorem inhibováno. T4 ze
vzorku soutěží s donorem označeným T4 o specifickou protilátku vůči T4.
Katalytická aktivita vznikající β-galaktozidázy (donor + akceptor) je
přímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku. Detekční limit 6,45 nmol/l. Rozsah
metody 6,45 – 258 nmol/l. Preciznost metody v sérii je CV 1,7 – 5,1 %,
mezi dny 2,6 – 9,2 %; výtěžnost 100 – 103 %. Odezva na ředění 98 – 107 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T4 je také v kompetitivním uspořádání a obvykle
používá jako značku křenovou peroxidázu. Ovčí protilátka vůči T4 je zakotvená
v jamkách mikrotitračních destiček. Po konkurenční imunoreakci T4 ze séra
a konjugátu T4 s POD se jamky vymyjí a přidá se substrát tetrametylbenzidin.
Barevná reakce se zastaví 1M HCl a absorbance se měří při 450 nm vertikálním
fotometrem. Detekční limit metody je 5,16 nmol/l. Rozsah měření je do 322
nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 1,4 – 2,9%, mezi sériemi
2,7 – 3,9 %. Výtěžnost metody je 86 – 105 %.Odezva na ředění 92 – 109 %. Homogenní
fluorescenční imunoanalýza využívá ke stanovení T4 fluorescenční polarizace
(FPIA). T4 označený fluoresceinem a T4 ze vzorku soutěží o vazebná místa
specifické protilátky. Množství emitovaného polarizovaného světla při 525 – 550
nm (excitace 485 nm) závisí na tom kolik konjugátu T4 s fluoresceinem se
naváže na protilátku. Polarizované světlo ze značeného imunokomplexu, který je
velký a rotuje pomalu bude mnohem větší, než z rychle rotujícího malého
konjugátu. Vlivem T4 ze vzorku je množství fluoresceinu v imunokomplexu
menší a polarizovaný signál slabší. Takže tímto postupem lze stanovit
koncentraci T4 ve vzorku, která je nepřímo úměrná emitovanému polarizovanému
světlu při FPIA. Detekční limit metody byl 25 nmol/l. Reprodukovatelnost
v sérii měla CV 1,82 – 5,02 %, mezi sériemi 0,89 – 4,54 %, celkově 2,77 –
6,74 %. Křížová reaktivita T3 byla < 10 %.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza (fluorometric enzyme immunoassay FEIA) je radiální rozdělovací technika,
kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická
vůči T4 je imobilizována na malé plošce filtračního papíru ze skleněných
vláken. Jako marker slouží T4 značený ALP. T4 ze vzorku a konjugát ALP-T4 se
nechají postupně reagovat s imobilizovanou protilátkou. Po inkubaci se
provede promytí roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní
substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se
promývacím roztokem vymyje volný T4 z plochy, kde je měřena fluorescence
(plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je
fluorochrom. Intenzita fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku
a je měřena fluorimetrem.
Fluorescence rozložená v čase je heterogenní kompetitivní postup s použití chelátů europia jako
značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce probíhá
v mikrotitračních destičkách. Imunokomplex s monoklonální protilátkou
vůči T4 je pak zachycen pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou
potaženy stěny jamek. Po promytí jsou ionty europia disociovány z vázané
fáze a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo
úměrná množství T4 ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,9 – 6,3
%, mezi sériemi 5,5 – 7,0 %; výtěžnost 95 – 106 %. Analytická citlivost metody
je 5 nmol/l. Rozsah měření do 300 nmol/l. Křížová reaktivita při 50 %
zastoupení: D-tyroxin 56 %, kyselina 3,3´,5-trijódothyrooctová 14 %,
3,3´,5-L-trijódtyronin 5,2 %.
Fluorescence s použitím suchých činidel je metoda založená na
měření signálu imunokomplexu protilátky značené rhodaminem s T4. Sérum se
nanese na film, kde je T4 vytěsněn ze svých vazebných proteinů. Volný T4 pak
prochází přes další vrstvu, kde vytěsní rhodaminem značený T4 z imobilizované
protilátky.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je v kompetitivním
uspořádání. T4 ze vzorku soutěží s T4 navázaným na paramagnetické částice
o omezený počet vazebných míst na specifické protilátce označené esterem
akridinu. Po krátké inkubaci jsou paramagnetické částice odděleny
v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka
s esterem akridinu. Pak jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu
vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku
hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a
emisi luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm
je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku. Metoda je
použitelná bez ředění do 387 nmol/l. Mez
detekce je 3,9 nmol/l; výtěžnost 92,0 – 112,5 %. Odezva po ředění 90 – 111,4 %.
Preciznost v sérii CV 1,19 – 3,15 %, mezi sériemi 1,47 – 4,57 %, celkem
1,89 – 5,55 %. D-tyroxin se má vysokou interferenci 57,7 %, reverzní
trijódtyronin 2,7 %, L-trijódtyronin 1,2 %.
LIA stanovení
s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je
navázána myší monoklonální protilátka proti lidskému tyroxinu. Kulička se
inkubuje 30 minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným tyroxinem, kdy
dochází ke konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu
odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky
jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 13 – 309 nmol/l. Analytická
citlivost 5 nmol/l. Preciznost v sérii 6,3 – 8,4 %, mezi sériemi 6,7 – 9,8
%; odezva na ředění 95 – 109 %, výtěžnost:
103 - 111 %.
Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje
po imunoreakci na kompetitivním principu, kdy se vzorek inkubuje
s biotinem značeným T4 a soutěží o specifickou protilátku, značenou
ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se paramagnetické
mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou
biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané
látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na
elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou
stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Metoda je použitelná v rozsahu 5,4 – 320 nmol/l. Detekční
limit je 5,4 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 4,7 %, mezi
sériemi 2,7 – 6,9 %.
Imunoanalýza
zesílená částicemi (particle-enhanced immunoassay PIA) se provádí
tak, že se smísí vzorek s konjugátem Ficoll-T4. Ficoll je roztok
polysacharidu, který slouží jako aglutinační činidlo. Po krátké inkubaci se
přidá protilátka vůči T4 navázaná na mikročástice a zahájí se aglutinační
reakce mezi konjugátem T4 a protilátkou navázanou na mikročásticích. T4 ze
vzorku snižuje podíl aglutinace, neboť soutěží s konjugátem o vazebná
místa protilátky zakotvené na mikročásticích. Míra aglutinace se měří při 600
nm turbidimetricky a je nepřímo úměrná množství T4 ve vzorku.
Plynová
chromatografie s elektronovým záchytem používá
derivatizace a N,O-diheptafluorobutyrylmetylesterové deriváty lze stanovit
s mezí detekce 0,2 pg. Chromatografii předchází purifikace na katexu.
HPLC používá ke
stanovení elektrochemický detektor.
Izotopová diluce s GCMS byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T4
v séru. Při tomto postupu se přidává určité množství T4 označeného 2H
k fixnímu množství séra. T4 je pak izolován ze séra extrakcí,
derivatizován na N,O-bis(trifluoracetyl)metylester a analyzován GCMS
s héliem jako nosným plynem. Simultánně se přitom sledují ionty
Izotopová diluce s LCMS elektrosprejí používá jako vnitřní standard tyroxin-d5, který
je přidáván do séra. Následuje vysrážení bílkovin a extrakce pevné fáze do
etylacetátu. Jako mobilní fáze slouží 0,1 % kyselina octová v acetonitrilu
ve směsi s vodou pro pozitivní ionty
National Institute of Standards and Technology připravil dva standardní
referenční materiály (sérový pool dospělých mužů a sérový pool dospělých žen
před menopauzou), obsahující také tyroxin s označením SRM 971. Hormony ve
zmrazeném lidském séru jsou k dispozici od roku 2009.
Podle výsledků studie z USA 2001 se hodnoty preciznosti CV pohybují v intervalu 3 – 9 % pro vzorky
s průměrnou koncentrací 129 nmol/l. Laboratoře by měly pracovat (CLIA-88)
s chybou ±20 % nebo 12,9 mmol/l. Intraindividuální variace T4 u zdravých
je 3,5 % během jednoho týdne a 7,4 % během jednoho roku. Požadovaná analytická
preciznost, odvozená ze studii biologické variace je 3,0 %.
Toleranční limit EHK: 13 %.
Interference
Koncentrace T4 je v séru snížena: androgeny, antikonvulsiva,
citronan, dehydroepiandrosteron, dirastan, fenytoin, furosemid, hemolýza
(silná), hladovění, kyselina gentisová, karbamazepin, kyselina
hydroxyfenylpyrohroznová, kouření, lithium, močovina, oxalát, peritoneální
dialýza, plazmaferéza, růstový hormon, sodanton, stres, thyreotom, aj.
Koncentrace T4 je v séru zvýšena: bilirubin (jen extrémní hodnoty),
dijódtyrosin, erytropoetin, fenylbutazon, hemodialýza, heroin, kyselina
trijódthyrooctová, kyselina trijódthyropropionová, menopauza, monojódtyrosin,
obezita, prostaglandiny, thyreoidin, triacylglyceroly (EIA), aj.
Koncentrace T4 je v moči zvýšena během menstruace.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-03