Stanovení volného
tyroxinu (fT4)
Synonyma
L-tyroxin, thyroxin, FT4
3,5,3´,5´-tetrajódtyronin
Preanalytická fáze
Při analýze se dává přednost séru. Krevní elementy je nutné
odstranit co nejdříve po odběru.
Doporučuje se transport krve do laboratoře do 6 h. Koncentrace fT4 se
nemění ani po 7 dnech v séru za laboratorní teploty. Nicméně se doporučuje
sérum skladovat při 4 °C, pokud se neanalyzuje do 24 h. Jestliže je doba mezi
odběrem a analýzou delší než 6 dní, je třeba vzorek zamrazit na -20 °C nebo ještě
nižší teplotu. Po rozmrazení je nutné vzorky jemně, ale dobře rozmíchat. Při
intenzivním míchání může dojít k denaturaci bílkovin. Opakované zamrazení
se nedoporučuje. Nepoužívejte heparin a nestanovujte fT4 u pacientů léčených
heparinem. Ruší také přídavek EDTA, citronanu nebo fluoridu. Jiný pramen
připouští použití EDTA nebo heparinové plazmy a doporučuje odběr nalačno.
Některé neizotopové imunometody neumožňují ředit vzorky při vysokých
koncentracích fT4. Používání hemolytických a lipemických sér se nedoporučuje.
Silikonované odběrové zkumavky mohou vadit u některých analytických postupů.
V některých případech dochází k vazbě fT4 na separační gely.
Stabilita v séru: 20 - 25 °C: 8 h – 2 dny, 4 - 8 °C: 1 – 14 dní,
-20 °C: 1 – 3 měsíce. Výsledky ovlivňuje věk. Biologický poločas v plazmě
5 – 8 dnů.
Poznámky k
analytické metodě
Koncentrace volné frakce je velmi nízká (pmol/l). Přibližně 0,03 %
z 96 nmol/l T4 v plazmě je ve volné formě (29 pmol/l). První postupy
používaly nepřímého měření s využitím rovnovážné dialýzy nebo
ultrafiltrace. Byly vyvinuty také metody využívající ke značení radionuklidy (3H,
131I, 125I). V současnosti se téměř výhradně
používají kompetitivní neizotopové metody, ačkoliv metody vyšší kvality
používají v úvodní fázi rovnovážnou dialýzu nebo ultrafiltraci.
Rozhodující faktory při analýze fT4 jsou: inkubační teplota (vazba na
TBG je při 37 °C a za laboratorní teploty odlišná), inkubační doba (musí být
dostatečně dlouhá pro dosažení rovnováhy kompetitivní reakce), vliv iontů při
vazbě fT4 na proteiny (chloridy a fosforečnany inhibují vazebnou schopnost a
obdobně působí endogenní látky jako fenoly, volné mastné kyseliny, salicyláty,
furosemid), ztráty fT4 (pohlcováním do buněk, nebo adsorpcí na skle) a ředění
séra (součástí metody je ředění pufrem, kdy dochází ke zvýšení vazby fT4 na
proteiny, např. při stonásobném ředění je úbytek fT4 2 %).
RIA
je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu.
Značkou je 125I. Používaný postup je známý také pod označením SPALT
(solid-phase antigen-linked technique), kdy je antigen vázaný na pevné
fázi. Antigen ze vzorku soutěží s fT4 vázaným na pevné fázi o omezené
množství vazebných míst monoklonální myší protilátky označené 125I. Protilátka váže < 1 % T4 vázaného na bílkovinu.
Rozsah metody 1,7 – 126 pmol/l. Analytická citlivost (2 SD) je 1,67 pmol/l.
Preciznost v sérii dosáhla CV 3,6 – 4,2 %, mezi sériemi 3,4 – 4,8 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza na sendvičovém principu používá dvoustupňovou reakci. Vzorek je inkubován
s oxidem chromičitým , který je potažený monoklonální protilátkou
vůči T4 na kterou se váže fT4 ze vzorku. Po magnetické separaci se promytím
odstraní ze vzorku vazebné bílkoviny pro T4 a přidá se konjugát T3-ALP, který
reaguje s neobsazenými vazebnými místy protilátky na částicích CrO2.
Nenavázaný
konjugát je odstraněn promytím. ALP
defosforyluje syntetický flavinadenindinukleotid fosfát (FADP) na FAD. Ten se váže na apo d-aminokyselinovou
oxidázu a přeměňuje ji na aktivní holo d-aminokyselinovou oxidázu, jež
katalyzuje tvorbu peroxidu vodíku z d-prolinu a kyslíku. H2O2
v přítomnosti křenové peroxidázy převádí
3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonovou kyselinu a 4-aminoantipyrin na barevný
produkt, který se měří bichromaticky při 510 nm proti 700 nm v kinetickém
režimu. Barevná změna je nepřímo úměrná koncentraci fT4 ve vzorku. Rozsah měření 2,57 – 83,7 pmol/l. Vyšší
koncentrace se neředí. Analytická citlivost je 2,57 pmol/l. Reprodukovatelnost
v sérii 1,3 – 3,2 % (při koncentraci 6,18 pmol/l 13,1 %), celková
reprodukovatelnost 3,1 – 6,5 % ( při koncentraci 6,18 pmol/l 20,6 %).
Interference 342 µmol/l bilirubinu, 10 g/l hemoglobinu, resp. 5,65 mmol/l
triacylglycerolů jsou < 10 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T4 je také v kompetitivním uspořádání a obvykle
používá jako značku křenovou peroxidázu. Protilátka vůči T4 je zakotvená
v jamkách mikrotitračních destiček. Po konkurenční imunoreakci T4 ze séra
a konjugátu T4 s POD se jamky vymyjí a přidá se peroxid vodíku a substrát
tetrametylbenzidin. Barevná reakce se zastaví 1M HCl a absorbance se měří při
450 nm vertikálním fotometrem. Detekční limit metody (2 SD) je 0,65 pmol/l.
Rozsah měření je do 95,2 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV
3,25 – 10,98 %, mezi sériemi 6,01 – 10,81 %. Křížová reaktivita d-tyroxin 98 %,
l-trijódtyronin 3 %, d-trijódtyronin 1,5 %.
FIA používá latexové
mikrokuličky (MEIA) potažené monoklonální protilátkou vůči fT4, značkou je
ALP a substrátem 4-metylumbelliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm (excitace
při 365 nm). K izolaci latexových kuliček se používá frita ze skleněných
vláken. Rozsah metody 5,15 – 77,2 pmol/l. Citlivost metody je 5,15 pmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,1 – 5,96 %, mezi sériemi 0 – 5,26 %,
mezi dny 0 – 7,69 % a celkově 3,63 – 9,99 %.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza (fluorometric enzyme immunoassay FEIA) je radiální rozdělovací technika,
kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická
vůči T4 je imobilizována na malé plošce filtračního papíru ze skleněných
vláken. Jako marker slouží T4 značený ALP. T4 ze vzorku a konjugát ALP-T4 se
nechají postupně reagovat s imobilizovanou protilátkou. Po inkubaci se
provede promytí roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní substrát).
Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím
roztokem vymyje volný T4 z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha
s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je
fluorochrom. Intenzita fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku
a je měřena fluorimetrem. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 3 – 6,5 %,
mezi sériemi 8 – 11 %.
Fluorescence rozložená v čase (DELFIA) je heterogenní sekvenční postup s použitím chelátů europia
jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce
probíhá v mikrotitračních destičkách. Monoklonální protilátka vůči T4 je
zachycena pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny
jamek. Po inkubaci a promytí se přidá vzorek a fT4 reaguje s paratopy
specifické protilátky. Opět následuje inkubace a promytí a přidá se europiem
značený T4, které obsadí zbylá vazebná místa na protilátce. Po promytí a
přidání zesilovacího roztoku jsou ionty europia disociovány z vázané fáze
a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná
množství T4 ve vzorku. Rozsah metody 2 – 80 pmol/l. Analytická citlivost metody
je 2,68 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 5,3 – 9,8 %, mezi
sériemi 3,9 – 14,1 %.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je založena na
rovnovážné imunochemické kompetitivní reakci s následnou detekcí záblesku
vzniklého chemiluminiscenční reakcí. Volný tyroxin stanovovaný ve vzorku
pacientského séra soutěží s přidaným fT4 značeným esterem akridinu o
omezený počet vazebných míst na polyklonální králičí protilátce vůči fT4. Tato
specifická protilátka je vázaná kovalentně na paramagnetických částicích niklu.
Reakce probíhá 7,5 min při 37 °C. Po odstranění nemagnetického materiálu
odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu, který vyvolá
chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem při 400 nm. Intenzita záření
je nepřímo úměrná koncentraci fT4 ve vyšetřovaném vzorku. Linearita metody: do
155 pmol/l, detekční limit: 1,3 pmol/l (2 SD), preciznost dosahuje v sérii
CV: 2,22 – 4,69 %, v čase: 1,58 – 4,59 %.
Chemiluminiscenční
imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) je dvoustupňová metoda. Během
prvního kroku se přidá vzorek k paramagnetickým mikročásticím, které jsou
potažené protilátkami vůči T4. fT4 přítomný ve vzorku se naváže na protilátky
na mikročásticích. Po promytí se během druhého kroku přidá konjugát T3 s
akridinem. Do reakční směsi se poté přidají roztoky peroxidu vodíku a hydroxidu
sodného. Výsledná chemiluminiscenční reakce je nepřímo úměrná koncentraci fT4
ve vzorku. Rozsah metody 5,15 – 77,2
pmol/l. Citlivost metody je 5,15 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV
2,3 – 3,8 % a celkově 3,8 – 7,8 %.
LIA stanovení
s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní sekvenční imunochemické
reakci. Pevnou fázi prezentují polystyrénové kuličky potažené myší monoklonální
protilátkou specifickou vůči lidskému T4. Do reakční zkumavky s kuličkou
se přidá vzorek séra a T4 konjugovaný s biotinem. Inkubace probíhá 30 min při
37 °C za protřepávání. Během této doby soutěží volný T4 ze vzorku
s konjugovaným T4 o omezený počet vazebných míst protilátky na kuličce.
Nenavázaný materiál se pak odstraní odstředěním a promytím. Do zkumavky se pak
přidá ALP vázaná na streptavidin. Po další 30 minutové inkubaci se nenavázaný
enzymový konjugát odstraní odstředěním a promytím.Přidá se substrát adamantyldioxetanfenylfosfát,
který se hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního
meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se (po 5 minutové
inkubaci při 37 °C s mícháním) detekuje luminometrem. Intenzita záření je
nepřímo úměrná koncentraci volného T4 ve vyšetřovaném vzorku. Optimální
koncentrace blokujících činidel brání biotinovanému T4 ve vazbě na endogenní
bílkoviny (včetně albuminu), zatímco vazebné vlastnosti přirozeného T4 se
nemění. Blokační činidla také minimalizují interference vznikající při
abnormálních hladinách albuminu nebo volných mastných kyselin. Konjugát T4
s biotinem nemá měřitelnou vazebnou afinitu vůči TBG. Specifická
protilátka váže T4 přibližně tak pevně jako albumin, takže nedochází
k oddělení hormonu od tyreoidálních vazebných proteinů. Linearita metody:
do 77,2 pmol/l, detekční limit: 2,32 pmol (2 SD), citlivost: 2,57 pmol (CV £ 20 %), preciznost v sérii dosahuje CV < 7,6
%, v čase (při koncentraci 8,62 pmol/l) < 9,1 %.
Homogenní
sekvenční chemiluminiscenční imunoanalýza (LOCI) je založena na sendvičovém principu. Dvě
činidla jsou zakotvena na kuličkách a dále je v reakci použitý
biotinylovaný fragment myší monoklonální protilátky vůči fT4. První kulička
(Chemibeads) je potažena trijódtyroninem, který má slabší vazebné schopnosti než
T4, a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá kulička (Sensibeads) je
potažena streptavidinem a obsahuje barvivo citlivé na světlo. Vzorek je
inkubován s biotinylovanou protilátkou a na její volná místa se naváže T4.
Pak se přidá první kulička s T3 a vznikne imunokomplex (obsadí se volné
pozice), který po přidání druhé kuličky vytvoří sendvič se
streptavidin-biotinovým můstkem. Ozářením imunokomplexu světlem 680 nm vzniká
na fotocitlivém barvivu singletový kyslík, který difunduje do chemiluminiscenčního
barviva a spouští chemiluminiscenční reakci. Generované světlo se měří při 612
nm a je nepřímo úměrné koncentraci fT4 ve vzorku. Rozsah metody 1,3 – 103
pmol/l. Analytická citlivost (2 SD) byla 12,3 pmol/l. Reprodukovatelnost
v sérii je CV 1,36 – 1,96 %, mezi sériemi 1,57 – 2,81 %.
Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje
po imunoreakci na sekvenčním principu, kdy se vzorek inkubuje se specifickou
protilátku, značenou ruthéniovým komplexem a pak se přidá s biotinem
značený T4, který obsadí zbývající volná místa na specifické protilátce a
současně se přidávají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se paramagnetické mikročástice
zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na
základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na
základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Metoda je použitelná v rozsahu 0,3 – 100 pmol/l. Detekční limit
je 0,3 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,4 – 2,9 %, mezi sériemi 2,6
– 6,6 %. Vzorky
pro stanovení fT4 nesmí být ředěny, jelikož T4, přítomný v krvi, má volnou frakci a frakci vázanou na
bílkoviny v rovnováze. Změna v koncentraci vazebných proteinů by porušila tuto
rovnováhu.
Plynová
chromatografie s elektronovým záchytem používá po
dialýze derivatizace a N,O-diheptafluorobutyrylmetylesterové deriváty lze
stanovit na koloně OV-17 při
Rovnovážná dialýza spojená s izotopovým ředěním, LC a tandemovou MS byla navržena jako mezinárodní referenční metoda. Stanovení se provádí
v dialyzátu. Další postup odpovídá stanovení celkového T4. Pro izotopovou
diluci se používá jako vnitřní standard tyroxin-d5, který je
přidáván do séra.Po dialýze slouží jako mobilní fáze 0,1 % kyselina octová
v acetonitrilu ve směsi s vodou pro pozitivní ionty
Jako
primární referenční materiál byl WG-STFT (Working Group for Standardization of Thyroid Function Tests IFCC)
doporučený materiál s označením IRMM-468. Jedná se o čištěný tyroxin 98,6
%, certifikovaný MS s rozšířenou nejistotou 0,7 %.
Na základě celkové
biologické variace 15,4 % bylo navrženo, že vychýlení při měření fT4 by mělo
být ≤ 4 %.
Toleranční limit EHK: 13 %.
Interference
Koncentrace fT4 je v séru snížena: antikonvulsiva, dirastan, fenobarbital, fenytoin, furosemid,
hemodialýza, IGF-1, karbamazepin, kontraceptiva,
laktace (pokles až 16 %), lithium, peritoneální dialýza, sodanton, těhotenství,
thyreotom, ztráty bílkovin, aj.
Koncentrace fT4 je v séru zvýšena: acetylsalicyláty, amiodaron,
cvičení, erytropoetin, fenylbutazon, heparin, heroin, Intralipid, reverzní
trijódtyronin (< 3,2 %), thyreoidin, D-trijódtyronin (< 2 %), D-tyroxin
(+52 %), aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-03