Stanovení
salicylátů
Synonyma
Kyselina acetylsalicylová při klasických fotometrických reakcích interferuje a v nomenklatuře bývá často chybně zaměňována za kyselinu salicylovou, která je metabolickým produktem kyseliny acetylsalicylové.
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru
případně v plazmě (antikoagulant heparinát sodný) – odběr 2 – 6 h po
aplikaci, separační gely mohou ovlivnit výsledky; kvalitativní test také
v moči.
Stabilita vzorku: 4 – 8 °C: 7 – 14 dnů.
Biologický poločas
závisí na dávce, 2 - 4 h po dávce < 3 g,
15 až 19 (i 30) h po velkých dávkách
Poznámky k analytické metodě
Spektrofotometrické
metody:
První metodou bylo
měření komplexu železitých iontů se salicyláty. Salicyláty se extrahovaly do
dichloretanu a pak zpětně do vodní fáze (výtěžnost 90 %), kde se měřily při 540
nm. Později byl eliminován extrakční krok a v další variantě se pak
použilo srážení chloridem rtuťnatým.
Další typ
fotometrické metody použil redukce salicylátů fosfowolframovými a
fosfomolybdenovými kyselinami (Folin–Ciocalteuovo činidlo) a vzniklé modré
zbarvení se měřilo při 660 nm po 3 min. Reprodukovatelnost CV 5,5 – 23,4 %. Při
analýze interferuje tryptofan, tyrosin a kyselina močová.
Diferenciální UV
spektrometrie používá měření rozdílu absorbance při pH 9 a 13,5
s citlivostí 15,4 µmol/l.
Kinetická metoda
dosahuje dobrou preciznost i při nízkých koncentracích salicylátů (méně než 308
µmol/l). Enzym salicylát hydroxyláza z Pseudomonas
cepacia katalyzuje přeměnu salicylátů na katechol a současně dochází
k oxidaci NAD(P)H na NAD(P)+ kyslíkem. Absorbance se měří při
340 nm. Specifičtější je ale měřit vznik katecholu než spotřebu NADH. Rozsah
metody je 100 – 7200 µmol/l, po naředění až 36000 µmol/l. Reprodukovatelnost
v sérii CV 1,0 – 3,2 %, celková reprodukovatelnost 1,5 – 4,4 %; nejistota
4,1- 10,8 %.
Fluorimetrické
metody: jsou citlivější než fotometrické.
Salicyláty se
oddělí od bílkovin vysrážením zředěnou kyselinou wolframovou. Přidáním silné
zásady se salicyláty převedou na fluoreskující formu (excitace 370 nm, emise
460 nm).
Také na koloně s
gelem Sephadex lze separovat salicyláty a měřit (excitace 305 nm, emise 405
nm).
Při další metodě
se k reaktantům přidává octan hořečnatý, barbituran sodný a etandiol
(excitace 340 nm, emise 390 nm).
FPIA využívá kompetice mezi léčivem ze vzorku a
léčivem označeným derivátem fluoresceinu o vazebná místa na protilátce.
V imunokomplexu má fluorescein omezenou pohyblivost a vyšší emisi
polarizovaného světla. Množství konjugátu v imunokomplexu je tím nižší,
čím je více léčiva ve vzorku, tedy měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci
salicylátů ve vzorku. Reprodukovatelnost CV
5,7 – 9,3 %.
Plynová chromatografie dovoluje stanovit vedle sebe salicyláty a
acetylsalicyláty. Po extrakci do etheru (spolu s p-toluenovou kyselinou
jako vnitřním standardem), odpaření a derivatizaci
bis(trimetylsilyl)trifluoracetamidem se provádí separace na koloně 5 % OV-17
při 150 °C. Detekce se provádí plameno-ionizačním detektorem. Citlivost 3,08
µmol/l, linearita do 6160 µmol/l.
HPLC začíná vysrážením bílkovin kyselinou
chloristou. Chromatografie probíhá na reverzní fázi s mobilní fází
metanol-voda. S použitím UV detekce při 235 nm je detekční limit 4,9 µmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii CV 2,94 %, mezi dny 2,7 %.
Lze použít i fluorimetrický detektor. V tomto
případě se používá k precipitaci kyselina trichloroctová. Při této
variantě neinterferuje teofylin. Detekční limit je 3,08 µmol/l, linearita do 1540 µmol/l. Reprodukovatelnost CV 11,5 –
14,1 %. Metoda je jednodušší a rychlejší než GLC.
O GLC i HPLC se uvažuje jako
o referenčních metodách.
Standardní referenční materiál nabyl do roku 2010
publikován.
Kvalitativní kapkový test
Salicylát dává fialové zbarvení v přítomnosti
železitých iontů. K analýze se používá sérum a není-li k dispozici,
tak moč.
Kvalitativní kompetitivní imunoreakce s konjugátem
salicylátu a koloidního zlata o specifickou protilátku má cut-off pro salicylát 308 µmol/l.
Údaje z roku 2001 (College of
American Pathologists Report) uvádějí preciznost 2 – 7% při průměrné
koncentraci 554 µmol/l. V analytické skupině (CLIA-88) jsou přijatelné
výsledky ±3.0 SD nebo ±10 % od průměru.
Interference
Výsledky stanovení kyseliny salicylové snižují: antacida,
benzothiazolethiol, bilirubin (v
koncentraci 2,92 – 11,7 µmol/l snižuje salicyláty o 30 – 154 µmol/l), EDTA,
thiosíran sodný, aj.
Výsledky stanovení
kyseliny salicylové zvyšují: albumin (je-li < 35 g/l), acetoacetát,
acylpyrin, anopyrin, askorutin, azid sodný (zvyšuje i hladinu v moči), celaskon,
diflunisal, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-03