Stanovení
prostatického specifického antigenu (PSA)
Synonyma
prostatický specifický antigen, celkový PSA, antigen PSA; prostate
specific antigen, total PSA
EC 3.4.21.77, semenogelasa, α-seminoprotein, seminin, P-30 antigen,
γ-seminoglykoprotein, γ-SM, lidský žlázový kalikrein, lidský
kalikrein 3, hK3
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí
v séru, případně v plazmě (antikoagulant EDTA, heparin nebo citronan)
a výjimečně také v moči. Dává se přednost vyšetření nalačno.
Stabilita vzorku: 20 - 25 °C: 3 h plazma – 24 h sérum (7 dní ?), 2
- 8 °C: 5 – 14 dní, -20 °C: 1 měsíc plazma, 6 měsíců – 12 let sérum.
Opakované zamrazení se nedoporučuje. Biologický poločas PSA je 2,2 – 3,2 dnů.
Výsledky ovlivňuje věk a cirkadiánní rytmy.
Ultrasenzitivní
test PSA měří hodnoty od 0,001 µg/l a může se kromě vyšetřování mužů po
prostatektomii použít i u vyšetření žen s karcinomem prsu (pozor
v těhotenství je fyziologicky zvýšený).
Typické pro stanovení PSA jsou neizotopové imunoanalýzy na principu EIA,
FIA a LIA. Většina dostupných metod je obtížně navzájem porovnatelná, protože
jejich výsledky závisí na použitých standardech, specifitě protilátek a čistotě
antigenů, použitých pro výrobu protilátek. Pro výrobu monoklonální protilátkou
definovaného vnitřního standardu PSA byla doporučena vysoce účinná
imunoafinitní chromatografie.
Pro stanovení PSA byl popsán aglutinační test s protilátkou vůči
PSA na latexových částicích.
Pro měření PSA byly také navrženy izoelektrická fokusace, imunodifuze,
imunoelektroforéza a raketková imunoelektroforéza.
Později byly publikovány testy EIA
ve standardním provedení nebo s dvou- a třímístným použitím enzymů
na polystyrénových kuličkách.
ELISA používá
mikrotitrační jamky potažené
monoklonální protilátkou vůči PSA. Po přidání vzorku se pipetuje druhá
monoklonální protilátka vůči PSA, značená křenovou peroxidázou a
tetrametylbenzidin jako substrát. Reakce probíhá v kyselém prostředí a
měří se absorbance při 450 nm. Preciznost metody v sérii je CV 2,5 – 4,05
%, mezi sériemi 4,0 – 4,5 %; výtěžnost 95 – 100 %. Efekt nadbytku antigenu
nebyl pozorován do 10000 µg/l.
Jako marker lze použít také ALP, substrátem je
pak 4-nitrofenylfosfát a detekci lze provádět při 405 – 450 nm.
Další enzymová imunoanalýza na sendvičovém
principu používá jednokrokovou reakci, kdy je vzorek inkubován s oxidem
chromičitým a konjugátem ß-galaktosidázy,
které jsou potažené monoklonální protilátkou rozeznávající různé epitopy na
PSA. Nenavázaný konjugát je odstraněn magnetickou separací. Sendvič oxid
chromičitý-Ab1-PSA-Ab2- β-galaktosidáza s
β-d-galaktopyranosidem chlorfenolové červeně. Hydrolýzou se uvolňuje
chlorfenolová červeň a barevná změna při 577 nm je přímo úměrná koncentraci PSA
ve vzorku. Lze měřit i bichromaticky
s druhou vlnovou délkou 700 nm. Rozsah měření 0,13 – 100 µg/l (vyšší
koncentrace nutno ředit). Povolená chyba metody CV 5,2 – 5,5 %.
Reprodukovatelnost v sérii 1,9 – 4,8 % (při koncentraci 0,09 µg/l 15,6 %),
celková reprodukovatelnost 3,2 – 6,7 % ( při koncentraci 0,09 µg/l 25,6 %).
Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 15000 µg/l. Výtěžnost metody je 96 –
103 %. Analytická citlivost je 0,05 µg/l, funkční citlivost je 0,13 µg/l.
Technologie IRMA používá dvě myší monoklonální protilátky proti
odlišným epitopům molekuly PSA. Značkou je 125I. Citlivost je 0,1
µg/l. Reprodukovatelnost metody je v sérii CV 2,5 – 3,3 %. Efekt nadbytku
antigenu se projevuje při koncentraci vyšší než 5000 µg/l. Tuto interferenci
může odstranit použití dvojstupňové namísto jednostupňové metody.
Je popsána také kompetitivní RIA metoda.
FIA používá magnetické nebo
latexové mikrokuličky potažené monoklonální protilátkou vůči PSA, značkou je
ALP a substrátem 4-metylumbelliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm
(excitace při 365 nm). V případě použití magnetických mikrokuliček
je citlivost metody 0,01 µg/l. Celková preciznost CV 3,5 – 4,0 %; výtěžnost
88,6 – 105,9 %.
V případě latexových kuliček se používá k jejich izolaci
frita ze skleněných vláken. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,3 – 5,4 %,
mezi sériemi 0 – 4,5 %, mezi dny 1,0 – 4,6 % a celkově 4,3 – 7,5 %; výtěžnost
96 – 102 %. Citlivost metody je 0,1 µg/l.
Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá polyklonální kozí protilátku značenou
esterem akridinu a druhou protilátku, která je ukotvena na paramagnetických
částicích. Luminiscence je nastartována alkalickým peroxidem vodíku a měří
se při 400 nm. Metoda je použitelná bez ředění do 100 µg/l. Efekt
nadbytku antigenu se projevuje při koncentraci 10000 µg/l. Analytická citlivost je 0,01 µg/l; výtěžnost
92,6 – 107,3 %. Preciznost v sérii CV 2,08 – 4,38 %, mezi sériemi 1,56 –
4,67 %, celkem 2,60 – 5,97 %.
Jestliže podobná
imunoreakce probíhá na latexových kuličkách (CMIA) je preciznost
CV < 5 %, linearita reakce do 100 µg/l, funkční citlivost 0,025 µg/l a
analytická citlivost 0,001 µg/l.
LOCI technologie
(Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) je homogenní sendvičová
chemiluminiscenční imunoanalýza. První činidlo obsahuje latexovou kuličku
potaženou monoklonální protilátkou proti PSA + chemiluminiscenčním barvivem a
také volný fragment F(ab´)2 monoklonální protilátky vůči PSA
s biotinovou kotvou. Druhé činidlo obsahuje jinou latexovou kuličku
potaženou streptavidinem a fotosenzitivní barvivo. Vzorek se inkubuje
s prvním činidlem a na kuličku s monoklonální protilátkou vůči PSA se
naváže antigen PSA a na něj druhá protilátka s volnou biotinylovou kotvou
(vytvoří se sendvič). Pak se přidá druhé činidlo a vytvoří se můstek
streptavidin-biotin. Při iluminaci zářením 680 nm se z fotosenzitivního
barviva druhé kuličky uvolní kyslík ve formě radikálu a difunduje do
chemiluminiscenčního barviva první kuličky, kde vyvolá emisi světla 612 nm,
která je přímo úměrná koncentraci PSA ve vzorku. Analytická citlivost je 0,008 µg/l, detekční limit 0,010 µg/l, funkční
citlivost 0,033 µg/l. Opakovatelnost metody má CV 1,19 – 2,93 %,
reprodukovatelnost mezi laboratořemi 2,31 – 5,18 %; výtěžnost 99 – 110 %.
Vychýlení vlivem hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a
triacylglycerolů (33,9 mmol/l) bylo < 10 %. Efekt nadbytku antigenu se
neprojevil do 50000 µg/l.
LIA stanovení
s využitím volného substrátu je založeno na sendvičové imunochemické reakci. PSA se
v prostředí pufrovaného roztoku jedním epitopem váže na polyklonální kozí
protilátku imobilizovanou na polystyrénové kuličce a druhým epitopem reaguje s
monoklonální myší protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce
probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a
promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci PSA ve vyšetřovaném vzorku.
Výsledky
jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je
určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 150 µg/l. Detekční limit:
0,04 µg/l (2 SD), citlivost: 0,04 µg/l (CV ≤ 20 %). Preciznost
v sérii (2,8 µg/l): < 5,1 %, v čase (11,4 µg/l): < 5,4 %;
výtěžnost: 91 - 108 %. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 22500 µg/l.
ALP
může reagovat i s jiným luminiscenčním činidlem, např. Lumi-Phos 530.
Takto lze dosáhnout analytické citlivosti až 0,008 µg/l. Preciznost metody má
CV < 7 % a efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 50000 µg/l.
Elektrochemiluminiscence následuje po
imunoreakci na sendvičovém principu, kdy se vzorek inkubuje
s biotinylovanou monoklonální protilátkou, specifickou vůči PSA a
monoklonální protilátkou, specifickou vůči PSA značenou ruthéniovým komplexem a
vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se mikročástice potažené
streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí
magneticky na povrchu elektrody.Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na
základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na
základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Metoda je použitelná v rozsahu 0,003 – 100 µg/l. Detekční limit
je 0,003 µg/l, funkční citlivost 0,03 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV
1,2 – 1,7 %, mezi sériemi 1,6 – 3, 7 %.
Řada
firem také nabízí kvalitativní průkaz PSA jako domácí vyšetření. Analýza
je na imunochromatografickém principu a nebývá blíže specifikována, ale obvykle
je jako marker používáno koloidní zlato.
V roce 2000 byl představen WHO a NCCLS referenční
standard obsahující 100 % volného PSA s kódem 96/686 a další standard
obsahující 90 % PSA v komplexu s α1‑antichymotrypsinem
a 10 % volného PSA s kódem 96/700.
Data z USA 2001 uvádějí preciznost 4 – 8 % při koncentraci 10 µg/l.
Kritéria CLIA-88 pro přesnost uvnitř skupiny jsou ± 0,2 µg/l. Intraindividuální
variace je 14 %, analytická preciznost by vzhledem k biologické variaci
měla být ≤ 7 %.
Toleranční limit EHK: 15 %.
Interference
Přítomnost heterofilních protilátek nebo nespecifických vazeb může
zapříčinit jak falešně nižší, tak falešně vyšší výsledky.
Koncentrace PSA je zvýšena: masáž prostaty, obstrukce moče, ultrazvuk
prostaty, tělesná zátěž (zejména jízda na kole), při zácpě.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-04