Stanovení volného
prostatického specifického antigenu (fPSA)
Synonyma
free PSA, PSA II, fPSA
fPSA je oficiální
zkratka i když se v některých firemních publikacích objevuje také FPSA
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí
v séru, případně v plazmě (antikoagulant EDTA, heparin nebo
citronan). Dává se přednost vyšetření nalačno.
Stabilita
vzorku: 20 - 25 °C: 3 h plazma, 24 h sérum; 2 - 8 °C: 14 dní plazma, 8 h – 14
dní sérum; ‑20 °C: 1 měsíc plazma, 2 – 4 měsíce sérum, při -70 °C i déle.
Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 3 h při doporučené teplotě
20°C. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Volný PSA je směsí několika izoforem PSA. Biologický poločas volného PSA je necelé 2 h. Výsledky ovlivňuje věk a cirkadiánní rytmy.
Poznámky k analytické metodě
Typické pro stanovení fPSA jsou neizotopové imunoanalýzy na principu EIA,
FIA a LIA. Většina dostupných metod je obtížně navzájem porovnatelná, protože
jejich výsledky závisí na použitých standardech, specifitě protilátek a čistotě
antigenů, použitých pro výrobu protilátek.
ELISA používá mikrotitrační jamky potažené monoklonální protilátkou vůči
fPSA. Po přidání vzorku se pipetuje druhá monoklonální protilátka vůči fPSA,
značená křenovou peroxidázou a tetrametylbenzidin jako substrát. Reakce
probíhá v kyselém prostředí a měří se absorbance při 450 nm. Citlivost
metody je 0,1 µg/l. Imunoreakce mezi fPSA a oběma protilátkami může proběhnout
volně v jamce, je-li jamka potažena streptavidinem a první protilátka je
biotinylovaná. Preciznost této metody v sérii je CV 7,8 – 9,3 %, mezi
sériemi 5,2 – 11,3 %.
Další enzymová imunoanalýza na sendvičovém
principu používá jednokrokovou reakci, kdy je vzorek inkubován s oxidem
chromičitým a konjugátem ß-galaktosidázy,
které jsou potažené monoklonální protilátkou rozeznávající různé epitopy na
fPSA. Nenavázaný konjugát je odstraněn magnetickou separací. Sendvič oxid
chromičitý-Ab1-fPSA-Ab2- β-galaktosidáza s
β-d-galaktopyranosidem chlorfenolové červeně. Hydrolýzou se uvolňuje
chlorfenolová červeň a barevná změna při 577 nm je přímo úměrná koncentraci PSA
ve vzorku. Lze měřit i bichromaticky
s druhou vlnovou délkou 700 nm. Rozsah měření 0,06 – 45 µg/l (vyšší
koncentrace nutno ředit). Povolená chyba metody CV 6,75 – 7,0 %.
Reprodukovatelnost v sérii 1,5 – 3,7 % (9,6 % při koncentraci 0,07 µg/l),
celková reprodukovatelnost 2,3 – 4,8 % (15,7 % při koncentraci 0,07 µg/l),.
Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l. Výtěžnost metody je
průměrně 100 – 104 %. Analytická citlivost je 0,05 µg/l, detekční limit 0,06
µg/l.
Technologie IRMA používá dvě myší monoklonální protilátky proti
odlišným epitopům molekuly fPSA. Značkou je 125I. Reprodukovatelnost
metody je při výsledcích > 0,5 µg/l v sérii CV 12,3 – 19,1 %, mezi
laboratořemi 18,1 – 26,0 %.
FIA používá magnetické nebo
latexové mikrokuličky potažené monoklonální protilátkou vůči fPSA, značkou je
ALP a substrátem 4-metylumbelliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm
(excitace při 365 nm).
V případě použití magnetických mikrokuliček je detekční limit 0,01
µg/l. Metoda je použitelná od 0,01 do 100 µg/l fPSA. Reprodukovatelnost v sérii
CV 2,85 – 3,02 %, mezi sériemi 2,69- 3,32 %; výtěžnost 97,0 – 103,6 %.
Interference < 10 % je v případě hemoglobinu do 4,45g/l, volného bilirubinu do 273,6
µmol/l, triacylglycerolů do 11,3 mmol/l, kyseliny askorbové do 1135,6 µmol/l,
lidský albumin do 50 g/l a heparinu do 100 kU/l.
V případě latexových kuliček se používá k jejich izolaci
frita ze skleněných vláken.Celková preciznost má CV 4,0 – 4,1 %. Citlivost
metody je 0,02 µg/l.
DELFIA technologie používá dvě
protilátky. Kotvící monoklonální protilátka je vůči celkovému PSA a druhá
monoklonální protilátka značená Eu3+ je vůči volnému PSA. Detekční
limit je 0,004 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 1,5 – 3,3 %, mezi
sériemi 2,3 – 4,1 %; výtěžnost 80,6 – 106,5 %.
Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči
celkovému PSA značenou esterem akridinu a druhou myší monoklonální
biotinylovanou protilátku vůči volnému PSA, která je ukotvena na paramagnetických
částicích potažených streptavidinem. Luminiscence je nastartována
alkalickým peroxidem vodíku a měří se při 400 nm. Metoda je
použitelná bez ředění do 25 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se projevuje při
koncentraci 10000 µg/l. Funkční citlivost
je 0,01 µg/l; výtěžnost 90,9 – 114,7 %. Preciznost v sérii CV 2,0 – 5,3 %,
mezi sériemi 0,8 – 5,2 %, celkem 3,5 – 7,9 %. Interference s metodou jsou
< 5 % při koncentracích hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a
bilirubinu 427,5 µmol/l.
Jestliže podobná
imunoreakce probíhá na latexových kuličkách (CMIA) je detekční limit 0,008 µg/l. Celková preciznost CV
6,2 – 9,2 %.
LOCI technologie (Luminescent
Oxygen Channeling Immunoassay) je homogenní sendvičová chemiluminiscenční
imunoanalýza. První činidlo obsahuje latexovou kuličku potaženou monoklonální
protilátkou proti celkovému PSA +
chemiluminiscenčním barvivem a také volný fragment F(ab´)2
monoklonální protilátky vůči volnému PSA s biotinovou kotvou. Druhé
činidlo obsahuje jinou latexovou kuličku potaženou streptavidinem a
fotosenzitivní barvivo. Vzorek se inkubuje s prvním činidlem a na kuličku
s monoklonální protilátkou vůči tPSA se naváže antigen tPSA a na něj druhá
protilátka vůči fPSA s volnou biotinylovou kotvou (vytvoří se sendvič).
Pak se přidá druhé činidlo a vytvoří se můstek streptavidin-biotin. Při
iluminaci zářením 680 nm se z fotosenzitivního barviva druhé kuličky
uvolní kyslík ve formě radikálu a difunduje do chemiluminiscenčního barviva
první kuličky, kde vyvolá emisi světla 612 nm, která je přímo úměrná
koncentraci fPSA ve vzorku. Analytická
citlivost je 0,005 µg/l, detekční limit 0,015 µg/l, funkční citlivost 0,030
µg/l. Opakovatelnost metody má CV 1,25 – 1,64 %, reprodukovatelnost mezi
laboratořemi 2,32 – 3,78 %; výtěžnost 96 – 104 %. Vychýlení vlivem hemoglobinu
(5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) bylo < 10
%. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 50000 µg/l.
LIA stanovení
s využitím volného substrátu je založeno na sendvičové imunochemické reakci. fPSA
se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním
epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrénové
kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného
materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop fPSA s polyklonální
králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min
při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se
přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s
alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá
za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo
úměrná koncentraci fPSA ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle
kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě
dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového
kódu činidla. Linearita metody je do 25 µg/l. Detekční limit: 0,02 µg/l (2 SD),
citlivost: 0,02 µg/l (CV ≤ 20 %). Reprodukovatelnost v sérii má CV
< 5,6 %, mezi sériemi < 6,2 %; výtěžnost:
84 - 110 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 µg/l.
ALP může reagovat
i s jiným luminiscenčním činidlem, např. Lumi-Phos 530. Detekční limit je 0,005 µg/l. Metoda je
použitelná do 20 µg/l fPSA. Celková preciznost CV 2,5 – 6,0 %. Efekt nadbytku
antigenu se neprojevuje do 20000 µg/l.
Elektrochemiluminiscence následuje po
imunoreakci na sendvičovém principu, kdy se vzorek inkubuje
s biotinylovanou monoklonální protilátkou, specifickou vůči fPSA a
monoklonální protilátkou, specifickou vůči fPSA značenou ruthéniovým komplexem
a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se mikročástice potažené
streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí
magneticky na povrchu elektrody.Nenavázané látky se odstraní pomocí
tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na
základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na
základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu
činidla. Metoda je použitelná v rozsahu 0,01 – 50 µg/l. Detekční limit je
0,01 µg/l, funkční citlivost 0,02 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,0
– 2,8 %, mezi sériemi 3,4 – 5,5 %. Stanovení není ovlivněno bilirubinem < 1 112 μmol/l, hemoglobinem
< 15 g/l, lipémií < 15 g/l a biotinem < 123 nmol/l.
V roce 2000 byl představen WHO a NCCLS referenční
standard obsahující 100 % volného PSA s kódem 96/686.
Data z USA 2005 uvádějí analytickou preciznost 7,2 % (DELFIA)
a biologickou variaci 7,5 – 9,7 %.
Toleranční limit EHK: 16 %.
Interference
Přítomnost
heterofilních protilátek nebo nespecifických vazeb může zapříčinit jak falešně
nižší, tak falešně vyšší výsledky.
Koncentrace fPSA je zvýšena: masáž prostaty, obstrukce moče, ultrazvuk
prostaty, tělesná zátěž (zejména jízda na kole), při zácpě.
Další informace
Petr Štern, 2011-01-04