Stanovení opiátů

Stanovení opiátů

 

Synonyma

Skupinové označení pro narkotika, např. heroin, morfin, dihydromorfin, propoxyfen, metadon, meperidin, fentanyl, aj.

morfin ≡ 7,8-didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorfinan-3,6-diol

heroin ≡ diacetylmorfin ≡ 7,8-didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorfinan-3,6-diol diacetát

dihydromorfinon ≡ hydromorfon ≡ 4,5-epoxy-3-hydroxy-17-methylmorfinan-6-on

 

Synonyma pro morfin: Astramorph, Contin, Duramorph, Epimorph Dolcontin, Oramorph, Roxanol, Sevredol, Statex, aj.

 

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí obvykle v moči, nebo v plazmě, séru, slinách či tkáňovém extraktu. Pokud se používají skleněné zkumavky, musí být silanizované, aby se předešlo adsorpci opiátů na jejich stěnách. Vzorky lze skladovat při 20 až 25 °C 7 dnů, -20 °C 3 - 12 měsíců (SEKK uvádí nezamrazovat). Zakalené vzorky odstředit.

Biologický poločas 2 – 4 h

 

Poznámky k analytické metodě

 

KVALITATIVNÍ TESTY

 

Fluorescenci lze použít k průkazu opiátů. Moč se extrahuje při pH 8,5 až 9 (nebo krev, plazma či sérum) do směsi butanol/chloroform. Organická fáze se extrahuje do kyseliny a oxidace opiátů se provede pomocí K₃Fe(CN)₆. Fluorochrom se detekuje fluorimetrem při excitačním maximu 250 nm a emisním maximu 440 nm.

 

Tenkovrstvová chromatografie se provádí v moči při pH 10 až 11 (nebo krvi, plazmě, séru či tkáni) po extrakci do 25 % etanolu v chloroformu. Roztok se odpaří a odparek se rozpustí v malém množství metanolu a aplikuje na silikagelovou plotnu. Pro TLC se používá mobilní fáze chloroform–metanol–amoniak (90:10:1). Opiát se prokazuje pod UV lampou, párami jódu, roztokem jódu a jodoplatnatanu nebo roztokem ninhydrinu. Sleduje se hnědé zbarvení a hodnota R_f. Metoda vyžaduje poměrně velkou koncentraci opiátu. Výhodnější je použít polymerní adsorbující pryskyřice jako Amberlite nebo XAD-2, které adsorbují většinu organických sloučenin rozpustných ve vodě a tím lze prokázat opiáty v nižších koncentracích.

Plynová chromatografie se provádí po extrakci (které může předcházet alkalická nebo enzymová hydrolýza uvolňující opiáty z vazby s glukuronidem) octanem etylnatým z moče (nebo krve, plazmy, séra, tkáně, slin, vlasů či sklivce). Organická fáze se pak oddělí a odpaří do sucha. Odparek se derivatizuje trimetylsilylimidazolem nebo anhydridem kyseliny heptafluoromáselné. Ke kvalitativní nebo kvantitativní detekci se používá plameno-ionizační detektor nebo detektor elektronového záchytu (citlivost 0,1 µg/l, CV 2 %) nebo hmotnostní detektor (citlivost 0,5 µg/l, CV 5 %). Analýza trvá 1,5 – 2 h.

HPLC opiátů se provádí po extrakci alkalizované moče (nebo krve, plazmy, séra, tkáně či slin) na reverzní fázi oxidu křemičitého C₁₈ s mobilní fází 0,1 M NaH₂PO₄ v 25 % CH₃CN ve vodě, pH 4,8 (nebo směsí dichlormetan-aceton nebo metanolem) . Opiáty se detekují kvalitativně nebo kvantitativně při 254 nm. Lze použít i fluorimetrický detektor (citlivost 4 µg/l, CV 6 %), kdy se po extrakci z moče opiáty oxidují K₃Fe(CN)₆ a vzniká fluoreskující dimer. Je také možné použít kombinace HPLC-MS (citlivost 10 µg/l, CV 6,9 %). Analýza trvá 1,5 – 2 h.

 

Imunoanalýzy mají většinou kompetitivní uspořádání a poměrně častá je křížová reaktivita mezi jednotlivými opiáty.      

Hemaglutinační inhibice používá erytrocyty stabilizované formaldehydem v komplexu s konjugátem drogy vázané na albuminu. Erytrocyty jsou potaženy opiátem. Přidá se vzorek moče (séra nebo plazmy) a protilátka proti opiátu (obvykle morfinu). Opiát ze vzorku inhibuje aglutinaci erytrocytů s protilátkou. Neaglutinované erytrocyty tvoří vzájemně se prolínající granulky, zatímco aglutinující erytrocyty vytvoří charakteristický červený prstenec. Metoda je poměrně rychlá (1 h) a citlivá (200 µg/l), ale nespecifická; může být použita jak v kvalitativní, tak v kvantitativní analýze.

Technika založená na sledování spinu volných stabilních radikálů jako značky (FRAT) je homogenní kompetitivní metoda využívající nitroxidový radikál (NO^●). FRAT měří energii absorbovanou nepárovými elektrony při jejich přechodu ze základního do excitovaného stavu. Spektrum je strmé a úzké, když je droga volná a  široké a ploché, když je droga vázaná na protilátku. Strmost spektra (zvýšení amplitudy píku) je přímo úměrné množství volného značeného opiátu, nebo-li množství opiátu ve vzorku. Analýza se provádí kvalitativně nebo kvantitativně v moči, plazmě, séru nebo slinách.

EMIT je běžně používaná homogenní technika pro kvalitativní stanovení opiátů v moči.  Lysozym nebo malátdehydrogenáza jsou kovalentně vázané na opiát (obvykle morfin). Droga ze vzorku soutěží o vazbu na protilátce se značeným opiátem. Aktivita enzymového markeru je v imunokomplexu inhibována. Volný enzymový konjugát reaguje se substrátem a reakce se sleduje fotometricky při 340 nm pro dehydrogenázovou reakci a při 450 nm pro lysozymový marker. Změna absorbance je přímo úměrná množství drogy ve vzorku. Kvantitativní verze dosahuje citlivost 0,1 mg/l a CV 7 %. Výsledek je dostupný za 20 min  z 50 µl séra.

ELISA v kompetitivním uspořádání je velmi rozšířená kvalitativní technika pro sledování drog. Specifickou protilátkou jsou potažené jamky polystyrénových mikrotitračních destiček. Sérum, plazma nebo moč se pipetuje do jamky spolu s konjugátem opiát-enzym. Po inkubaci se nenavázaná droga odstraní promytím a po přidání substrátu se fotometricky měří kolik konjugátu se navázalo na protilátku. Výsledná absorbance je nepřímo úměrná koncentraci drogy ve vzorku. Kvantitativní verze dosahuje citlivost 0,1 mg/l a CV 5 % (plazma, sérum), 8 % (moč). Výsledek je dostupný za 1 h  z 10 µl vzorku.

RIA postupy s tritiem jako značkou (délka analýzy 1 – 2 h, ) mají vyšší citlivost než EMIT a ELISA, dosahují z 200 µl vzorku citlivost 2,5 µg/l a CV 9 %.

Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze (FPIA). Citlivost metody je 25 µg/l, přičemž 15 % výsledků při této koncentraci je falešně negativních. Reprodukovatelnost v sérii CV 0,54 %, mezi sériemi 0,89 %.

 

KVANTITATIVNÍ TESTY

 

Chromatografické postupy (GC, GC/MS, HPLC, HPLC/MS) jsou jediné vhodné pro sledování směsi opiátů, zvláště když je vyžadována kvantifikace všech farmakologicky účinných opiátů ve vzorku. Extrakční metody umožňují stanovení celkové koncentrace opiátů (hydrolýza před extrakcí umožní změření jak konjugovaných, tak nekonjugovaných opiátů) nebo pouze nekonjugovaných opiátů (extrakce bez hydrolýzy). Kyselá hydrolýza je rychlá (1 h), ale může některé opiáty rozložit (v rozsahu 4 – 15 %). Enzymová hydrolýza glukuronidázou opiáty neporuší, ale vyžaduje 24 h.

Pro sledování jednotlivých opiátů jsou vhodné imunochemické postupy. Opiáty jsou příliš malé molekuly, aby mohly reagovat jako imunogeny a musí být kovalentně navázány na větší molekulu, zpravidla na albumin. Interferenci glukuronidů lze eliminovat vhodnou protilátkou (reagující s pozicí C-3 morfinu) nebo extrakcí vzorku do organické fáze a rozpuštěním odparku ve fyziologickém roztoku.

 

GC nebo GC/MS je považována za nejlepší a nejcitlivější metodu pro stanovení opiátů. Má také nejnižší variační koeficient. Není ale snadno automatizovatelná a není vhodná při požadavku na stanovení velkého počtu vzorků.

 

Interference

Výsledky stanovení opiátů zvyšují: bromfeniramin, dextromethorfan, difenhydramin, doxylamin, efedrin, chinolonová antibiotika, chlorfeniramin, kodein, konjugát s 3-O-glukuronidem, nikotin, oxykodon, oxymorfon, pseudoefedrin, rifampin a konzumace máku.

Výsledky stanovení opiátů snižují: bělidla, citronany, šťavelany, zlaté plomby.

 

Další informace

Principy analytických postupů

 

 

Petr Štern, 2011-01-07