Stanovení
tricyklických antidepresiv
Synonyma
Hlavní generické názvy jsou (obchodní názvy): amitriptylin (Elavil, Tryptizol, Laroxyl), amitriptylinoxide (Amioxid,
Ambivalon, Equilibrin), butriptylin (Evadyne), clomipramin (Anafranil), demexiptilin (Deparon, Tinoran), desipramin (Norpramin, Pertofrane), dibenzepin (Noveril, Victoril), dimetacrin (Istonil, Istonyl, Miroistonil), dosulepin/dothiepin (Prothiaden), doxepin (Adapin, Sinequan), imipramin (Tofranil, Janimine, Praminil), imipraminoxid (Imiprex, Elepsin), lofepramin (Lomont, Gamanil), melitracen (Deanxit, Dixeran, Melixeran, Trausabun), metapramin (Timaxel), nitroxazepin (Sintamil), nortriptylin (Pamelor, Aventyl), noxiptilin (Agedal, Elronon, Nogedal), pipofezin (Azafen/Azaphen), propizepin (Depressin,
Vagran), protriptylin (Vivactil), quinupramin (Kevopril, Kinupril, Adeprim, Quinuprine).
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v plazmě (antikoagulans EDTA) nebo
séru (výjimečně ve slinách nebo moku). Použití heparinu se nedoporučuje,
protože může způsobit variabilitu výsledků. Vzorek by měl být odstředěný co
nejdříve po odběru a skladován v lednici.
Stabilita v séru: 20 – 25 °C 24 h, 4 °C 4 týdny, -20 °C déle než 1 rok.
Změkčovadla z gumových zátek mohou snižovat výsledky stanovení těchto
léčiv, dochází totiž k jejich redistribuci mezi erytrocyty a plazmou. Může
docházet k vazbě léčiva na separační gely. Kuřáci mohou mít nižší výsledky
než nekuřáci o 20 až 40 % vlivem enzymové indukce a urychlení metabolizmu
léčiva.
Biologický poločas v plazmě: amitriptylin 17 – 40 h,
nortriptylin 15 – 93 h, imipramin 6 – 24 h, desipramin 12 – 76 h, protriptylin
54 – 198 h, doxepin 8 – 36 h.
Poznámky k
analytické metodě
Přímá fluorimetrická detekce není dostatečně specifická (interferovaly
metabolity v extraktu léčiva po okyselení) a fotometrie v UV
oblasti je nejen málo specifická, ale také málo citlivá metoda. Fluorimetrické
metody byly později vylepšeny předřazením acetylace před okyselení a
navázáním α-bromakridinu na léčivo (vzniklá kvartérní sůl podléhá
fotochemickému rozkladu za vzniku fluorochromu. Tak byla dosažena citlivost 5
µg/l, ale metoda je pracná a pro dosažení specifity je potřebné zařadit do
analytického postupu TLC.
Izotopová diluce je výzkumná metoda, kdy je
léčivo extrahováno do hexanu, pak reaguje s radioaktivně (
Kompetitivní RIA měla od počátku (1975)
problém s křížovou reaktivitou mezi stanovovanou sloučeninou a jejími
metabolity, zvláště sekundárními a terciárními aminy. Naproti tomu křížová
reaktivita s hydroxy-deriváty je malá. Shoda RIA s ostatními postupy
není dobrá.
Vysycovací ELISA na mikrotitračních
destičkách používá křenovou peroxidázu jako marker protilátky a po imunoreakci
jako substrát tetrametylbenzidin. Stanovované léčivo reaguje s monoklonální králičí
protilátkou vůči myšímu séru. V následujícím kroku se reakční směs
pipetuje do mikrotitrační destičky a volná místa protilátky se naváží na povrch
destičky, který je potažený lysozymem a léčivem. Po promytí a reakci se
substrátem se měření provádí při 410 nm. Absorbance je nepřímo úměrná koncentraci
stanovovaného léčiva. Preciznost v sérii dosáhla CV 10 % a mezi sériemi 13
%.
Kompetitivní homogenní enzymová imunoanalýza EMIT
vykazuje pro jednotlivá tricyklická antidepresiva rozdílnou křížovou
reaktivitu. Je třeba provést extrakci na koloně C18 s následnou
elucí 50 % acetonitrilem v metanolu a fosfátovém pufru při pH
léčiva ve vzorku
měřit podle změny aktivity enzymu. Aktivní enzym převádí NAD+ na
NADH, což se projeví změnou absorbance při 340 nm. Endogenní sérová G6PDH při
tom neinterferuje, protože koenzym NAD+ působí pouze s bakteriálním
enzymem (Leuconostoc
mesenteroides) použitým v tomto
testu. Citlivost metody je 75 µg/l, rozsah měření do 1000 µg/l. Preciznost
v sérii dosahovala CV 0,7 – 1,1 %. Metoda
se používá poměrně často.
Fluorescenční homogenní polarizační technika FPIA
je často používaná technika. V kompetitivním uspořádání má léčivo značené
fluoresceinem v imunokomplexu s králičím antisérem vyšší
polarizovanou fluorescenci než volný konjugát. Emitovaná polarizovaná fluorescence
je nepřímo úměrná koncentraci léčiva ve vzorku. Křížová reaktivita mezi
jednotlivými tricyklickými antidepresanty je téměř 100 %, ale s jinými
léčivy jako lithium, benzodiazepiny nebo thioridazin je zanedbatelná. Nicméně
perazin interferuje významně. Citlivost metody je 20 µg/l. Rozsah měření do
1000 µg/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 4,13 – 6,10 %, celkem 4,66 – 6,69
%.
Kvantitativní postupy EMIT a FPIA stanovují léčivo a jeho metabolit
separátními metodami, ale chromatografické postupy je umožňují stanovit
paralelně. Tenkovrstevná chromatografie s denzitometrickou detekcí
(TLCD) má nízkou preciznost a zdlouhavou odezvu. K detekci používá UV
reflexní fotometrie. Separované sloučeniny reagují s nitrózními plyny za
vzniku intenzivně žlutých skvrn, které se měří denzitometrem. Postup má
přijatelnou specifitu a citlivost 5 µg/l, ale používá se jen ojediněle.
GLC používá plameno-ionizační
detektor nebo detektor elektronového záchytu. Původní postup byl málo citlivý,
což bylo vylepšeno používáním vnitřního standardu a třístupňovou extrakcí. Tím
se zlepšila reprodukovatelnost a snížil se počet interferentů. Použití OV-17
zvýšilo trvanlivost kolony. Nyní je citlivost 20 µg/l s plameno-ionizačním
detektorem. Léčiva lze převést na trifluoracetyl- nebo heptafluorbutyl-deriváty
a po třístupňové extrakci lze dosáhnout citlivosti 10 µg/l, ale derivatizace je
zdlouhavá (3 h), není použitelná pro terciární aminy a odezva pomalá. Většina
laboratoří upřednostňuje postup bez derivatizace. Preciznost je za těchto okolností
22 – 32 %.
Nejvíce citlivá a specifická je GC/MS. Jako vnitřní standardy se
používají deuterovaná léčiva, která mají stejné chromatografické vlastnosti.
Postup je náročný na technické vybavení.
HPLC (1975) je často používaná
metoda. Je to třístupňová extrakce, podobně jako u GLC. Používají se různé
kolony s obrácenými fázemi a fotometrická detekce při 254 nebo 211 nm.
Citlivost je podobná jako u GLC, ale nedochází k rozkladu vzorku
v detektoru. Derivatizace není zapotřebí a proto dávají laboratoře přednost
HPLC před GLC. Nicméně extrakce vyžaduje asi 3 h. Mobilní fáze jsou podle typu
analytu např. acetonitril/izopropylalkohol 95:5 + n-butylamin nebo
acetonitril/voda 74:26 + n-butylamin. Kolony jsou: µPorasil LC nebo C18
µBondapak vyhřívané na 60 °C. Mezidenní
preciznost dosahovala CV 10 – 12 %, mezi laboratořemi 15 – 25 %. Citlivost byla
20 – 50 µg/l.
Kvalitativní důkaz se dělá při podezření
z akutního předávkování. První metody sledovaly přítomnost v moči
pomocí kapkových testů. Moč lze také extrahovat a následně separovat na TLC a
rozdělení zviditelnit ninhydrinem, jódoplatičitanem nebo Dragendorfovým
činidlem. Průkaz lze provést i pomocí GLC. Lze prokázat < 300 µg/l. Pomocí
koloidního zlata imunochemicky lze prokázat 200 – 500 µg/l (podle druhu
léčiva). Test čínského výrobce má citlivost v moči 1000 µg/l.
College of American Pathologists uvádí ve studii z roku 2001
preciznost pro tricyklické antidepresanty při koncentracích 200 – 400 µg/l CV
kolem 7 %. Pro kvalitativní test je dostačující přítomnost nebo nepřítomnost
sledovaného léčiva a správné rozlišování cutoff koncentrace.
Interference
Výsledky stanovení tricyklických antidepresiv jsou nižší u kuřáků a
vlivem barbiturátů, citronanu, glutethimidu, chloralhydrátu, aj.
Výsledky stanovení tricyklických antidepresiv zvyšují: alimenazin,
antihistaminika, antipsychotika, cimetidin, cyclobenzaprin, difenhydramin,
doxepin, hydrokortizon, chlorpromazin, karbamazepin, maprotilin, mesoridazin,
methylfenidát, mianserin, neuroleptika, orální kontraceptiva, perazin,
promazin, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15