Stanovení triacylglycerolů
Synonyma
triglyceridy (v české klinické biochemii
méně používané, ale správné označení, které je v anglické literatuře triglycerides 20x častější než triacylglycerols), triacylglyceridy
(nejméně používané označení)
Oficiální mezinárodní zkratka není. Zkratka
TG nebo Tg se používá asi dvakrát častěji než TAG. Nicméně TG (Tg) je
nejednoznačné vyjádření, protože současně platí i pro thyreoglobulin. Nejméně
se vyskytuje zkratka TRIG (Trig).
Preanalytická fáze
Je třeba zdůraznit, že odběr
musí být nalačno 12 až 14 h (24 h ?), protože hladina triacylglycerolů stoupá
postprandiálně asi po 2 h a dosahuje vrcholu po 6 až 8 h. Chilomikrony při
pipetování obsadí část prostoru v pipetě, takže vodný podíl je menší a
stanovení triacylglycerolů falešně nižší. Triacylglyceroly v plazmě jsou
nižší o 2 – 4 % ve srovnání se sérem, protože vlivem antikoagulancií (EDTA,
heparin) dochází k částečnému vytlačení vody z erytrocytů a tím ke
zředění plazmy. Některé antikoagulanty (fluoridy, citronan, šťavelan) mohou
způsobit snížení výsledku až o 10 %. Proto je třeba oddělit plazmu od krvinek
nejpozději do 2 h. Pacient by neměl pít alkoholické nápoje 36 h před odběrem,
jinak budou výsledky falešně vyšší. Zátky mohou být potaženy silikonem, avšak
ne glycerinem. Krev by měla být rychle centrifugována, aby nedocházelo ke
spontánní hydrolýze triacylglycerolů v krvi na mastné kyseliny a glycerol.
Pokud se neprovede analýza do 24
h, měl by být vzorek zamrazen na -20 °C, nebo raději na ‑40 nebo -60 °C,
či dokonce -80 °C. Jinde uvedena stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 2 – 3
dny, 4 – 8 °C: 7 – 10 dní, -20 °C: 2 roky.
Stanovení ovlivňuje věk, dieta, pohlaví a má
významný intraindividuální rozptyl; ruší ikterus.
Jedno stanovení není směrodatné.
Poznámky
k analytické metodě
Nejběžnější metody
ke stanovení triacylglycerolů jsou enzymové metody. Automatizovaná metoda na
principu Hantzschovy kondenzace je dosud navrhovanou a nezavrženou
referenční metodou. Tímto postupem lze měřit cholesterol a triacylglyceroly
paralelně. Hantzschova reakce je označení pro reakci acetylacetonu a
formaldehydu s octanem amonným, kdy vzniká žlutý
3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidin. Reakční produkt se měří fotometricky při 412
nm nebo fluorimetricky (primární filtr 400 nm, sekundární filtr 485 nm).
Detekční reakci předchází extrakce triacylglycerolů, jejich zmýdelnění na
glycerol a mastné kyseliny a oxidace glycerolu na formaldehyd.
Ačkoliv byly publikovány také postupy
stanovení triacylglycerolů na tenké vrstvě, plynovou a kapalinovou
chromatografií a IR spektrometrii, nejsou vhodné pro rutinní použití i když jsou někdy vysoce specifické.
Enzymové metody stanovují podíl glycerolu v molekule
triacylglycerolů po hydrolýze (chemické nebo enzymové) a odstranění mastných
kyselin. Obvykle se používá kombinace lipázy a proteázy (zejména
α-chymotrypsin). Při tomto způsobu hydrolýzy nedochází k uvolňování
glycerolů z fosfolipidů. Dosažení kompletní hydrolýzy je nutné pro správné
provedení metody.
Hydrolyzovaný
glycerol se obvykle fosforyluje ATP na glycerol-3-fosfát glycerolkinázou
v přítomnosti hořečnatých iontů. Vznikající ADP se regeneruje na
ATP tak, že odebírá fosfátovou skupinu z fosfoenolpyruvátu. Reakce je
katalyzovaná pyruvátkinázou a vzniká při ní pyruvát. V detekční reakci
(měření při 340 nm) se pyruvát redukuje na laktát a současně se oxiduje NADH na
NAD+. Reakci lze také upravit na fluorescenční detekci NADH
(primární filtr 355 nm, sekundární filtr 460 nm).
Také glycerol-3-fosfát
lze využít jako výchozí reaktant pro detekci. Může se oxidovat na
dihydroxyacetonfosfát pomocí NAD+, které se současně redukuje
na NADH. To lze opět měřit při 340 nm nebo nechat NADH reagovat dále
s oxidovanou formou 2-p-jódfenyl-3-nitrofenyl-5-fenyltetrazoliové soli za
katalýzy diaforázou a vzniká její redukovaná forma – formazanové barvivo –
které se měří fotometricky při 500 – 590 nm a NADH se přitom oxiduje na NAD+.
Glycerol-3-fosfát se může oxidovat
také vzdušným kyslíkem v přítomnosti L-α-glycerolfosfátoxidázy
na dihydroxyacetonfosfát, přičemž vzniká peroxid vodíku. Ten se využije
k detekci v Trinderově reakci se 4-aminofenazonem a 4-chlorfenolem,
kdy vzniká červené chinoniminové barvivo. Reakce je katalyzovaná peroxidázou a
jako redukční činidlo se někdy přidává ferokyanid draselný. Detekce se provádí
při 500 nm. Metoda je lineární do 11,4 mmol/l. Analytická citlivost je 0,1
mmol/l. Preciznost v sérii měla CV 3,0 %, celkem 4,5 %. Kaskáda tří
enzymových reakcí dle Fossatiho s následným stanovením peroxidu vodíku
v Trinderově reakci je nejvíce využívaným stanovením triacylglycerolů
v ČR.
Další postup oxiduje přímo glycerol pomocí NAD+
v přítomnosti glyceroldehydrogenázy na dihydroxyaceton a současně vzniká
NADH. To lze opět detekovat při 340 nm, nebo provést ještě následnou redukci
resazurinu pomocí NADH v přítomnosti diaforázy a vzniká fluoreskující
resorufin (primární filtr 548 nm, sekundární filtr 580 nm) a NAD+.
GC-IDMS stanovení, kde měřenou látkou je glycerol. Původní metoda používala 13C2-glycerol
jako vodný vnitřní standard a 12C-tripalmitin rozpuštěný
v toluenu jako vnější standard. Modifikovaná metoda používá tripalmitin
jako vnitřní i vnější standard. Vnitřní standard je tripalmitin značený na
glycerolové polovině (13C3-tripalmitin). K zachycení
glycerolu během odpařování extraktu po alkalické hydrolýze se přidává
k vnějšímu standardu lidský sérový albumin neobsahující glycerol.
Modifikovaná metoda je stabilnější než původní postup a MS signál je při
modifikované metodě u externího standardu alespoň stokrát silnější a preciznost
měla CV 1,5 % při koncentracích
Podle studie College of American Pathologists (2001) 2/3 laboratoří
používají detekce při 340 nm (doporučuje se používat sérový blank !) a 1/3
detekce ve viditelné oblasti. Správně by se od výsledku měl odečíst malý podíl
volného glycerolu, který se v séru také nachází. V praxi se to ale
neprovádí, protože je to pracné a nepohodlné (postup bez hydrolýzy a postup
s hydrolýzou). Nicméně podíl volného glycerolu může být vysoký (až 42 %
z celkového glycerolu).
Použití čitého standardu je důležité pro získání pravdivých výsledků.
Ověření čistoty se provádí TLC (stacionární fáze silikagel, mobilní fáze
kyselina octová/etyléter/petroléter 1:25:74). Jako standard se používá triolein
(izopropylalkohol jako rozpouštědlo), případně směs trioleinu a tripalmitinu
2:1 (chloroform jako rozpouštědlo), nebo kukuřičný, olivový olej či olej
z bavlníkových semen. Glycerol a manitol se nehodí jako standardy, protože
se chovají rozdílně při extrakci, adsorpci a zmýdelnění. Glycerol je kromě toho
hygroskopický. Nicméně se glycerol používá jako standard v enzymových
reakcích, protože je rozpustný ve vodě a při nich se nepoužívají organická
rozpouštědla. Vodné glycerolové standardy
nemají stejnou viskozitu jako vzorky séra. Molekulová hmotnost triacylglycerolů
je proměnlivá, např. tripalmitin má 807, zatímco triolein 885. Vlivem
rozdílných standardů se výsledky mohou lišit asi o 10 %.
Data ze studie
v roce 2001 ukázala, že preciznost stanovení je lepší než 7 % pro
koncentraci 2,26 mmol/l.
Intraindividuální variace během 14 měsíců byla 18 %, podle jiné studie
20 – 25 % během 1 měsíce. Interindividuální variabilita byla 37,2 %.
Z toho odvozená hodnota pro maximální CV je 10,5 %, celková chyba 27,9 %.
NCEP Laboratory Standardization Panel doporučuje CV < 5 % pro preciznost a
vychýlení ±5 % (jinde ±10,7 %) od výsledků získaných referenční metodou. Měření
by se měla provádět alespoň na třech koncentračních hladinách po dobu alespoň
jednoho týdne.
V roce 2009 byl připraven v Japonsku podle
směrnice C37-A v Ústavu pro klinické a laboratorní standardy (Clinical and
Laboratory Standards Institute) referenční materiál JCCRM 223-25 na dvou
koncentračních hladinách (1,0487±0,0113 a 2,0069±0,0170 mmol/l) navazující na
NIST SRM1951b. Primárním referenčním materiálem byl tripalmitin NIST SRM 1595 a
referenční metodou NIST byla ID-MS z roku 2008.
Toleranční rozpětí v EKK je 15%.
Interference
Koncentraci triacylglycerolů snižují:
askorutin, citronan, dieta, glukagon, glukóza, , hemoglobin (5 g/l), heparin
(intravenózně), IGF-I, interleukin-3, interleukin-6, cholesterol (18,1 mmol/l),
káva, kyselina askorbová, kyselina nikotinová, omega-3-mastné kyseliny (-31 až
-52 %), otruby, peritoneální dialýza, poloha vleže (-12 až ‑17 %), sója,
aj.
Koncentraci triacylglycerolů zvyšují:
bakteriální kontaminace (fosfolipáza), beta-blokátory, cyklosporin, cystein,
cystin, dieta, diuretika, estrogeny, etanol, etylenglykol, glycerol,
hemoglobin, heroin, ikterus, klomifen, krém na ruce, lipémie, menopauza,
obezita, orální kontraceptiva, retinoidy, růstový hormon, sitostanol, steroidy,
stres, tamoxifen, těhotenství, thiazidy, trimecryton, urandil, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15