Stanovení tobramycinu

Synonyma

AK-Tob, Brulamycin, Nebcin, Nebicin, Nebramycin Factor 6, Obracin, Tobi, Tobracin, Tobramycin Sulfate, Tobrex

4-amino-2-{4,6-diamino-3-[3-amino-6-(aminomethyl) -5-hydroxy-tetrahydropyran-2-yl]oxy- 2-hydroxy-cyclohexoxy}-6-(hydroxymethyl) tetrahydropyran-3,5-diol

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí především v séru, případně v plazmě (antikoagulans EDTA, heparin, citronan ?, šťavelan). Při i.m. aplikaci 60 min po injekci (maximum) a před další aplikací (minimum). Transportovat v chladu, odstřeďovat v chlazené centrifuze. Existuje riziko adsorpce na separační gely.

Stabilita vzorku: (sérum) 20 – 25 °C nestabilní, jinde 1 – 8 h, (plazma) 6 h; 4 – 8 °C (sérum) 3 – 7 dní, (plazma) 2 – 12 týdnů; -20 °C (sérum) 4 týdny, jinde uvedeno nemrazit ! Většinou se však jedno zamrazení dovoluje. V roce 2006 uvedena ve vědecké práci stabilita tobramycinu v plazmě 18 h a třikrát zamrazení bez vlivu na výsledky.

Biologický poločas tobramycinu je 2 – 3 h.

Poznámky k analytické metodě

Imunochemické postupy jsou nejběžnější.

První imunochemický postup, který byl použit byla kompetitivní RIA. Radioaktivní konjugát tobramycinu s ¹²⁵I soutěžil s tobramycinem ze vzorku o specifickou protilátku zakotvenou na zkumavkách. Po separaci volné a vázané fáze byl měřený signál ve zkumavce nepřímo úměrný koncentraci tobramycinu. Rozsah měření byl 0,2 – 34,2 µmol/l. Preciznost CV 7,11 – 10,78 %.

Homogenní enzymová imunoanalýza EMIT je založena na kompetitivním principu. Vzorek je přidán k tobramycinu označenému glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6P-DH), a pak je přidána protilátka vůči, dále glukóza-6-fosfát a NAD⁺. Enzymová aktivita G6P-DH po navázání na protilátku klesá, a proto může být koncentrace tobramycinu ve vzorku měřena jako aktivita G6P-DH. G6P-DH konvertuje NAD⁺ na NADH, což vede ke změně absorbance, která je měřena fotometricky při 340 nm. Endogenní G6P-DH v séru nevstupuje do reakce,

protože NAD⁺ je v testu účinná pouze s bakteriálním (Leuconostoc mesenteroides) enzymovým konjugátem. Pokles absorbance měřený dvoubodovou kinetikou je přímo úměrný koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rozsah metody 1,28 – 21,4 µmol/l. Analytická citlivost je 0,43 µmol/l. Preciznost v sérii měla CV 1,2 – 4,5 %, rámci laboratoře 1,6 – 3,9 %, celkem 1,7 – 4,8 %.

Při FPIA soutěží fluoresceinem značený tobramycin a volný tobramycin ze vzorku o vazebná místa specifické ovčí polyklonální protilátky. Pouze konjugát vázaný na protilátku poskytuje v polarizačním světle fluorescenční signál, takže měřená fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rozsah metody je do 21,4 µmol/l. Analytická citlivost 0,39 µmol/l. Preciznost v sérii CV 2,4 – 3,0 %, mezi sériemi 0,1 – 3,0 %, celkem 4,2 – 6,0 %; výtěžnost 96,1 – 118,6 %.

CEDIA využívá rekombinantní DNA technologie, kdy donor a akceptor enzymu po spojení vytvoří aktivní β-galaktosidázu, která reaguje s galaktopyranosidovým substrátem za vzniku barevného produktu chlorfenolové červeně. Kozí protilátka proti myší protilátce vůči tobramycinu zabraňuje vzniku aktivního enzymu pokud se neváže na tobramycin ze vzorku. Takže intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rozsah metody bez ředění je do 25,6 µmol/l. Analytická citlivost byla 0,51 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosáhla CV 2,3 – 6,7 %, celkem 3,4 – 7,3 %; výtěžnost 96 – 105 %.

Další popsaná metoda je bioluminiscenční imunoanalýza s luciferázou.

Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je v kompetitivním uspořádání. Tobramycin ze vzorku soutěží s tobramycinem označeným esterem akridinu o omezený počet vazebných míst na monoklonální myší protilátce navázané na paramagnetické částice. Po krátké inkubaci jsou paramagnetické částice odděleny v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka s esterem akridinu. Pak jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a emisi luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm je nepřímo úměrná koncentraci tobramycinu ve vzorku. Metoda je použitelná bez ředění do 27,8 µmol/l. Mez detekce (±2 SD) je 0,39 µmol/l; výtěžnost 99 – 133 %. Odezva po ředění 91 – 119 %. Preciznost v sérii CV 2,67 – 3,29 %, mezi sériemi 2,12 – 3,65 %, celkem 3,54 – 4,73 %.

LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je navázána králičí polyklonální protilátka vůči tobramycinu. Kulička se inkubuje 30 minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným tobramycinem, kdy dochází ke konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a po promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření 477 nm, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci tobramycinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 1,1 – 26 µmol/l. Analytická citlivost 0,2 µmol/l. Preciznost v sérii CV 4,1 – 6,5 %, celkově 4,8 – 8,0 %; odezva na ředění 79 – 113 %, výtěžnost: 95 – 110 %.

Turbidimetrická inhibiční imunoanalýza s využitím homogenních částic (PETINIA) používá syntetický konjugát částice s tobramycinem a specifickou monoklonální protilátku vůči tobramycinu. Tobramycin ve vzorku soutěží s konjugátem o protilátku a tím snižuje rychlost agregace. Proto je rychlost agregace nepřímo úměrná koncentraci tobramycinu ve vzorku. Rychlost agregace se měří pomocí bichromatického turbidimetrického měření při

340 nm a 700 nm. Rozsah metody do 25,7 µmol/l. Analytická citlivost 0,6 µmol/l. Preciznost v rámci laboratoře CV 3,0 – 6,21 %, celkově 5,35 – 16,26 %.

GLC používá kanamycin A jako vnitřní standard. Po okyselení se přidal acetonitril a provedla se derivatizace trimetylsilylimidazolem. Pak byl ještě přidán heptafluorobutyrylimidazol a směs vody a hexanu. Rozdělení bylo provedeno na koloně s 3 % OV-101 při 272 °C. Detekce byla prováděna pomocí detektoru elektronového záchytu. Rozsah měření 2,78 – 26,74 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 3,8 – 13, 5%.

LC/MS/MS začíná denaturací séra pomocí trichloroctové kyseliny. Dělení probíhá na koloně C₁₈ během 5 min. Mobilní fázi tvoří 0,5 % kyselina mravenčí a 2 mmol/l octanu amonného v metanolu. Během dělení postupně klesá gradient heptafluoromáselné kyseliny, který začíná na úrovni 6 mmol/l. Jako vnitřní standard byl použit sisomycin. K měření sloužil trojitý kvadrupól, vybavený zdrojem pro turbosprej iontů. V pozitivním modu byl sledován přechod m/z 468,3→163,2 pro tobramycin a m/z 448→160 pro sisomycin. Metoda byla lineární od 0,214 do 17,1 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii měla CV ≤ 7,1 %, mezi dny ≤ 4,7 %, vychýlení v sérii 6,9 % a mezi dny 7,1 %; výtěžnost z plazmy byla 75 %; matricový efekt 97 – 104 %.

Pro tobramycin je referenční standard pod označením CRS 3, uvedený v monografii European Pharmacopoeia 2008, který je vhodný pro kapalinovou chromatografii.

Toleranční rozpětí v EKK neuvedeno.

Interference

Výsledky stanovení tobramycinu snižuje: cefalosporiny, kapilární odběr (-9 %), penicilin, aj.

Výsledky stanovení tobramycinu zvyšují: amikacin, bilirubin > 256 µmol/l, dibekacin, 3´,4´-dideoxykanamycin B, gentamicin, hemoglobin (10 g/l +19 % FPIA), heterofilní protilátky, kanamycin A, kanamycin B, lipémie, neomycin, aj.

Další informace

Principy analytických postupů

Petr Štern, 2011-02-15