Stanovení teofylinu
Synonyma
Apo-Theo La, Aquaphyllin, Asmalix, Bronkodyl, 1,3-dimetylxantin,
Elixophyllin, Euphyllin,
Phyllocontin, Quibron-T, Slo-Bid, Slo-Phyllin, Sustaire, Syntophyllin, Theoclear-80, Theobid, Theo-Dur, Theolair,
Theosol-80, Theospan, Truphylline, Truxophyllin
1,3-dimethyl-7H-purin-2,6-dion
Poznámka: aminofylin není teofylin, ale směs teofylinu, etylendiaminu a
krystalické vody
Preanalytická fáze
Odběr 2 h po podání a před následující dávkou. Vzorek
transportovat v chladu a nemrazit. Stanovení se provádí v
séru popřípadě v plazmě (antikoagulans heparin, použití K2EDTA,
NaF nebo šťavelanu draselného se nedoporučuje, protože mohou interferovat při
analýze) nebo i plné krvi. Je možné také provádět vyšetření ve slinách (obvykle
pomocí HPLC), přičemž pacient žvýká parafinový vosk. Plná krev obsahuje 82 %
koncentrace teofylinu ve srovnání se sérem nebo plazmou. Při skladování vzorku
do 48 h nebyl pozorován rozdíl mezi použitím separačního gelu nebo jeho
absencí. Stanovení ovlivňuje věk, kouření, kofeiny a taniny. Koncentrace
v krvi závisí také na lékové formě a způsobu aplikace léku.
Stabilita
vzorku 4 – 8 °C: 1 týden. V řadě souprav je uvedeno, že vzorek je možné
skladovat při -20 °C 1 – 6 měsíců, ačkoliv se zamrazení nedoporučuje !
Biologický poločas 3 – 9 h.
První metodou stanovení teofylinu byla extrakce do směsi chloroformu
s izopropylalkoholem a reextrakce do ředěného hydroxidu sodného.
Absorbance vodného extraktu se měřila bichromaticky (277 a 310 nm). Později
byla eliminována interference barbituranů. Celková reprodukovatelnost měla CV
4,84 – 6,74 %, výtěžnost byla 87,0 – 93,5 %. Nicméně byl tento postup nahrazen
enzymovými a imunoanalytickými metodami, případně HPLC. Tím se zvýšila
specifita a rychlost stanovení a snížil se požadovaný objem vzorku.
Metoda nekompetitivní enzymové inhibice vychází z toho, že
teofylin je účinný nekompetitivní inhibitor ALP z hovězích jater.
Technologie tenkovrstvého filmu umožňuje využívat tento princip (konverze
p-nitrofenylfosfátu na p-nitrofenol pomocí ALP je inhibována teofylinem a
množství produktu je nepřímo úměrné stanovovanému léčivu. Není-li teofylin
přítomen, je rychlost přeměny substrátu na produkt nejvyšší. Absorbance se měří
při 400 nm ve dvou bodech po přidání vzorku. Rozdíl absorbance se používá
k určení koncentrace teofylinu na základě kalibrační křivky.
EMIT používá jako značku
glukóza-6-fosfátdehydrogenázu a kompetitivní uspořádání homogenní imunochemické
reakce. Léčivo ze vzorku a teofylin značený glukóza-6-fosfátdehydrogenázou
soutěží o vazebná místa specifické protilátky. Vznik imunokomplexu inhibuje
katalytickou aktivitu enzymové značky. Zbytková enzymová aktivita po inkubaci
je dána množstvím volného konjugátu a je přímo úměrná množství teofylinu ve
vzorku. Měří se při 340 nm jako rychlost přeměny NAD+ na NADH.
Rozsah metody 14 – 222 µmol/l, analytická citlivost 4,2 µmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii dosáhla CV 1,2 – 7,9 %, mezi sériemi 2,9 – 8,4
%.
CEDIA používá β-galaktosidázu geneticky upravenou na
dva inaktivní fragmenty (donor a akceptor). Donorová část je navázaná na
teofylin (konjugát) a konkuruje s lékem ze vzorku o omezený počet
vazebných míst protilátky. Protilátka kryje vazebné místo donoru pro akceptor a
proto po přidání volného akceptoru se může vytvořit aktivní enzym jen
z volného konjugátu a nikoliv z imunokomplexu. Substrátem pro
barevnou detekční reakci je β-D-galaktopyranosid chlorfenolové červeně a
uvolněné barvivo se sleduje při 575 nm. Nárůst absorbance chlorfenolové červeně
je přímo úměrný koncentraci teofylinu (dvoubodová kalibrace). Analytická
citlivost metody je 4,4 µmol/l. Rozsah měření je do 222 µmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 3,3 %, celkem 2,0 – 5,1 %. Odezva na
linearitu je 93,6 – 102,1 %, výtěžnost 100 – 107 %. Při stanovení interferuje
kyselina dimetylmočová.
Enzymová inhibiční imunoanalýza je v kompetitivním uspořádání a umožňuje stanovení v séru,
plazmě i plné krvi. Konjugát léčiva s inhibitorem enzymu soutěží
s teofylinem ze vzorku o volná místa na protilátce. Protilátka vázaná na
konjugát zabraňuje inhibici acetylcholinesterázy, takže množství produktu
měřené fotometricky je přímo úměrné koncentraci teofylinu. Acetylcholinesteráza
hydrolyzuje acetyl-β-(metylthio)cholinjodid na volný thiol, který reaguje
s 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) na thionitrobenzoát. Rychlost
vzniku zbarvení je přímo úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku.
Homogenní enzymová imunoanalýza v kompetitivním uspořádání využívá jako značku prostetickou skupinu
FAD, která je v imunokomplexu chráněná protilátkou a brání aktivitě GOD.
Apo-glukózaoxidáza vyžaduje pro svou aktivitu prostetickou skupinu FAD, která
je kovalentně vázaná na teofylin. Vlivem teofylinu ze vzorku se váže méně
konjugátu na protilátku a FAD se může uplatnit v enzymové reakci. GOD
oxiduje glukózu vzdušným kyslíkem na glukonolakton a současně se kyslík
redukuje na peroxid vodíku. V následné reakci peroxid vodíku oxiduje
v přítomnosti POD tetrametylbenzidin na barevný produkt. Absorbance při 740 nm je přímo úměrná
koncentraci teofylinu ve vzorku. Rozsah metody je do 222 µmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii měla CV 3,5 – 5,9 %, mezi sériemi 3,3 – 5,0 %;
výtěžnost 97 – 110 %.
Kompetitivní ELISA na mikrotitračních
destičkách používá křenovou peroxidázu jako marker a po imunoreakci jako
substrát tetrametylbenzidin.
Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční
polarizační imunoanalýze (FPIA). V kompetitivním uspořádání má
značené léčivo v imunokomplexu s myší monoklonální protilátkou vyšší
polarizovanou fluorescenci než volný konjugát. Emitovaná polarizovaná
fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci léčiva ve vzorku. Citlivost metody
je 4,55 µmol/l. Rozsah metody je do 222 µmol/l, vyšší koncentrace lze ředit
automaticky. Reprodukovatelnost CV v sérii je 1,7 – 2,5 %, mezi dny 0,4 –
0,8 %, celkem 1,9 – 2,6 %. výtěžnost 95,9 – 98,1 %. Při analýze interferuje
3-metylxantin.
Fluorimetrická imunoanalýza zesílená enzymem je v kompetitivním uspořádání, kde teofylin ze vzorku a teofylin
značený enzymem (bakteriální ALP) soutěží o protilátku zakotvenou na povrchu
skleněného vlákna. Po vymytí nenavázaného podílu se přidá substrát
(4-metylumbeliferylfosfát) a vznikající 4-metylumbeliferon se měří fluorimetrem.
Pokud není ve vzorku teofylin, dosáhne se nejvyššího signálu fluorescence,
protože se na imobilizovanou protilátku v reakční zóně naváže maximální
množství teofylinu s ALP. Reprodukovatelnost mezi dny měla CV 5,8 %,
výtěžnost byla 84 – 107 %.
Kompetitivní chemiluminiscence s esterem akridinu jako značkou je metoda při
které soutěží teofylin ze vzorku se značeným teofylinem 7,5 min. o omezený
počet vazebných míst na myší monoklonální protilátce, která je vázaná na
kotvící myší monoklonální protilátku kovalentně zachycenou na paramagnetické
částice. Volná frakce je odstraněna promytím a přidá se peroxid vodíku a roztok
hydroxidu sodného. Vzniklá luminiscence (detekovaná při 400 nm) je nepřímo
úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku. Rozsah metody je 2,2 – 222 µmol/l.
Analytická citlivost je 2,8 µmol/l. Odezva na ředění byla 90,2 – 109,9 %,
výtěžnost 88,2 – 105,4 %. Reprodukovatelnost
v sérii CV 3,7 – 5,3 %, mezi sériemi 0,8 – 3,3 %, celkem 6,1 – 9,6 %.
Nejistota byla 10,7 – 19,5 %.
LIA stanovení
s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je
navázána králičí polyklonální protilátka proti teofylinu. Kulička se inkubuje 30
minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným teofylinem, kdy dochází ke
konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a
promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který
hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu.
Ten se ihned rozpadá za vzniku záření 477 nm, které se detekuje luminometrem.
Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci teofylinu ve vyšetřovaném
vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj
specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a
vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 5,5 – 333
µmol/l. Analytická citlivost 1,7 µmol/l. Preciznost v sérii 4,1 – 12,1 %,
celkově 5,9 – 13,4 %; odezva na ředění 94 – 120 %, výtěžnost: 91 - 105 %.
Chemiluminiscenční
imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) je jednostupňová metoda. Vzorek se
smíchá s paramagnetickými mikročásticemi potaženými kozími protilátkami vůči
myším protilátkám proti teofylinu a s konjugátem teofylinu s akridinem. Po
inkubaci a promytí se přidají roztoky peroxidu vodíku a hydroxidu sodného.
Výsledná chemiluminiscenční reakce je nepřímo úměrná koncentraci teofylinu ve
vzorku. Rozsah metody do 222 µmol/l, vyšší
koncentrace nutno ředit manuálně. Citlivost metody je 0,28 µmol/l.
Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,2 – 4,1 % a celkově 4,6 – 7,0 %. Odezva
na linearitu 99 – 108 %, výtěžnost 94,3 – 104,6 %.
Turbidimetrická inhibiční imunoanalýza zesílená latexovými částicemi (particle enhanced turbidimetric
inhibition immunoassay PETINIA) je homogenní postup, kdy léčivo značené
částicemi soutěží s teofylinem ze vzorku o vazebná místa myší monoklonální
protilátky. Rychlost agregace je nepřímo úměrná množství volného teofylinu,
protože jen konjugát léčiva s latexem po navázání na protilátku tvoří
agregáty. Zákal se měří turbidimetricky při 340 nm nebo při 600 nm. Rozsah
měření 11 – 222 µmol/l. Analytická citlivost je 5,6 µmol/l. Preciznost
v sérii dosáhla CV 1,3 – 6,1 %, mezi sériemi 1,6 – 8,9 %. Triacylglyceroly
33,9 mmol/l snižují výsledky o 23,7 %.
Metoda KIMS je založena na kinetické
interakci mikročástic v roztoku. Protilátka proti teofylinu je kovalentně
vázána na mikročástice a derivát léčiva je připojen k makromolekule. Kinetická
interakce mikročástic v roztoku je vyvolána vazbou konjugátu léčiva na
protilátku na mikročástici a je inhibována přítomností teofylinu ve vzorku.
Kompetitivní reakce probíhá
mezi konjugátem léčiva a teofylinem ze séra vzorku
o vazebná místa protilátky proti teofylinu, navázané na mikročástice. Výsledná
kinetická interakce je nepřímo úměrná množství léčiva ve vzorku. Rozsah měření
3,3 – 222 µmol/l (vyšší hodnoty ředit 1+1 dilučním roztokem). Mez detekce je
3,3 µmol/l. Preciznost v sérii CV 0,5 – 1,0 %, mezi sériemi 1,7 – 2,1 %.
Výtěžnost 90 – 110 %, odezva na linearitu 97,3 – 110,0 %. Křížová reaktivita
aminofylin 79,6 %, 8-chlorteofylin 6,0 %, 1,7-dimetylxantin 5,2 %,
3-metylxantin 2,7 %, efedrin 1 %.
Kinetická nefelometrická inhibiční imunoanalýza (NIIA) je v kompetitivním uspořádání. Konjugát haptenu
s vysokomolekulární bílkovinou soutěží s léčivem ze vzorku o vazebná
místa na protilátce. Imunokomplex s konjugátem je nerozpustný a zvyšuje
rozptyl světla, takže rychlost růstu nefelometrického signálu je nepřímo úměrná
koncentraci léčiva ve vzorku. Při této nefelometrii se používá dvoubodová
kalibrace. Reprodukovatelnost mezi dny měla CV 4,5 %, výtěžnost 97 – 104 %.
GLC stanovení předchází extrakce
analytu do chloroformu nebo směsi chloroform-izopropylalkohol a jeho
derivatizace alkylací. Jako vnitřní standard se používá
3-izopropyl-1-metylxantin. Po nástřiku na kolonu 3 % OV-17 se používá
plameno-ionizační detektor nebo MS detektor. Postup je poměrně složitý a časově
náročný, takže se nehodí pro rutinní analýzu. Celková reprodukovatelnost měla
CV 4,74 – 9,42 %, výtěžnost 80,3 – 88,0 %.
GC/MS metoda používá jako vnitřní
standard [1,3-15N, 2-13C]teofylin, který je spolu se
vzorkem extrahován při pH 5,2 do směsi chloroform-izopropylalkohol. Extrakt se
derivatizuje s jódpentanem v alkalickém prostředí 10 min. Po GC
separaci se MS detektorem monitorují ionty m/z 250 teofylin a m/z 253 vnitřní
standard. Poměr těchto iontů se vynáší proti standardům teofylinu. Bylo
dosaženo preciznosti v sérii CV 0,37 – 0,96 %, celková preciznost byla
1,16 %; přesnost byla < 2,1 %; detekční limit metody je 55,5 nmol/l a rozsah
měření do 160 µmol/l. Metoda je doporučená jako referenční postup.
HPLC se používá pro analýzu
v séru po deproteinaci a extrakci nebo bez extrakce s rozdělením na
koloně C18 na obrácené fázi (acetonitril) s retenčním časem
méně než 10 min. Fotometrická detekce se provádí při 254 nm. Na
oktadecylsilanové koloně lze použít také jako mobilní fázi metanol
s vodnými roztoky solí. U metod nepoužívajících extrakce (postačuje 10 µl
séra) je někdy velký variační koeficient mezi sériemi. Většina postupů používá
jako vnitřní standard 8-chlorteofylin nebo 8-hydroxyteofylin a koncentrace
teofylinu se počítá porovnáním výšky nebo plochy píku. Interference ampicilinu,
cefalosporinů a methicilinu lze eliminovat extrakcí. Chloramfenikol a některé
cefalosporiny mohou interferovat i po extrakci. HPLC je často používaná jako
referenční metoda a je také poměrně levná. Celková reprodukovatelnost je CV
2,26 – 3,56 %; výtěžnost 94,0 -100,5 %.
LC/MS/MS postup používal jako
standard teofylin s 15N v poloze l a 3. Extrakčním
činidlem byl metanol. Teofylin se lépe stanovoval při pozitivní ionizaci,
zatímco jeho metabolity v negativním módu. Pro teofylin se sledoval m/z
179→164. Rozsah metody je 0,35 – 111 µmol/l. Analytická citlivost byla
0,15 µmol/l, funkční citlivost 0,35 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii
měla CV 1,6 % a mezi dny 7,4 %.
Standardní referenční materiál pochází z NIST (National
Institute of Standards and Technology), nese označení SRM 2384 a je společný pro teofylin, teobromin a kofein.
Podle přehledu College of American Pathologists (2002) je preciznost
stanovení teofylinu při koncentraci 72 µmol/l 4 – 8 %, jinde do 11 %. Přípustné
vychýlení od průměru skupiny podle CLIA-88 (Clinical Laboratory Improvement
Amendments) je ±25%. Specifita je ohrožena v séru uremiků (reagují také zvýšené
koncentrace 1,3-dimetylurátu). Křížová reaktivita s kofeinem (novorozenci)
je < 1 %.
Toleranční rozpětí v EKK je 27 %.
Interference
Výsledky stanovení teofylinu snižují: felodipin, fenytoin, hemoglobin (> 1,5 g/l), fenobarbital,
fenytoin, karbamazepin, kouření, lithium, marihuana, rifampin, aj.
Výsledky stanovení teofylinu zvyšují: aminoglutethimid, amiodaron,
adenin, alopurinol, Belomet, bilirubin, cefalosporiny, cimetidin,
ciprofloxacin, citronan, disulfiram,
EDTA, enoxacin, heparin (800 U/l),
erytromycin, chloramfenikol, 8‑chlorteofylin, klindamycin, kofein,
linkomycin, lipémie, kyselina 1,3-metylmočová, 3-metylxantin, norflexacin, oleandomycin, orální
kontraceptiva, perfloxacin, propranolol,
ranitidin, štavelan, Tagamet,
troleandomycin, viloxazin, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15