Stanovení takrolimu
Synonyma
tacrolimus,
tacarolimus, Tac
3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-hexadekahydro-5,19-dihydroxy-3-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyklohexyl)-1-methylethenyl]-14,16-dimethoxy-4,10,12,18-tetramethyl-8-(2-propenyl)-15,19-epoxy-3H-pyrido[2,1-c]
[1,4] oxaazacyklotrikosin-1,7,20,21(4H,23H)
-tetron monohydrát
Advagraf, Prograf, Protopic, Fujimycin, FK 506
Preanalytická fáze
Odběr 12 h po poslední dávce a bezprostředně před další dávkou.
Stanovení se provádí v celé krvi (antikoagulans EDTA).
Stabilita
vzorku 18 – 25 °C: 8 h, 4 – 8 °C: 7 dnů, -20 °C: 6 měsíců. Biologický poločas
21 (10 -14) h, rovnovážný stav za 2 – 3 dny.
Imunochemické postupy jsou nejběžnější, HPLC/MS/MS slouží spíše pro
srovnávací studie.
ELISA postup v kompetitivním
uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči takrolimu. Mikrotitrační
destička má jamky potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG. Po extrakci
lyzačním činidlem a odstředění se přidá supernatant vzorku a poté monoklonální
myší protilátka vůči takrolimu. Po inkubaci 20 min za laboratorní teploty se
přidá konjugát takrolimu s křenovou peroxidázou a následuje další
60 min inkubace. Po promytí jamek se přidá chromogen a barevná reakce se
zastaví po 15 min kyselinou sírovou. Absorbance se měří bichromaticky při 460
proti 630 nm a zbarvení je nepřímo úměrné koncentraci takrolimu ve vzorku.
Analytická citlivost 0,35 nmol/l. Rozsah metody je do 130 nmol/l. Preciznost CV
7,4 – 24,8 %, přesnost -10 až +53 %; výtěžnost 78 – 84 %.
Heterogenní enzymová analýza: Vzorek nejprve reaguje s lyzačním činidlem
(síran měďnatý). Pak se váže na konjugát protilátky vůči takrolimu
s navázanou β-galaktosidázou. Zbytek volných míst protilátky vůči takrolimu obsadí
takrolimus imobilizovaný na částice oxidu chromičitého. Po dosažení rovnováhy
se imunokomplex na částicích odstraní magnetickou separací. V supernatantu
je původní imunokomplex s β-galaktosidázou, který se převede do
reakční kyvety obsahující chlorfenolovou červeň s navázaným
β-d-galaktopyranosidem, který je enzymovým markerem rozštěpen na
chlorfenolovou červeň, absorbující při 577 nm. Nárůst absorbance se sleduje
bichromaticky (577 proti 700 nm) a je přímo úměrný koncentraci takrolimu ve
vzorku. Rozsah metody je 1,56 – 39 nmol/l. Analytická citlivost metody je 1,56
nmol/l, funkční citlivost 3,12 nmol/l. Preciznost dosáhla v sérii CV 1,5 –
10,7 %, celkem 2,1 – 11,6 %. Výtěžnost je 94,1 – 99,1 %.
Před postupem EMIT se vzorky,
kalibrátory a kontrolní materiály upraví lyzačním činidlem (síran měďnatý) a
metanolem. Krevní bílkoviny se vysráží, extrakt se centrifuguje a supernatant
se použije k analýze. Homogenní
enzymová imunoanalýza EMIT používá při kompetitivní reakci o
monoklonální myší protilátku vůči takrolimu analyt ze vzorku a konjugát
takrolimu s rekombinantní glukóza-6-fosfátdehydrogenázou. Volný konjugát
přeměňuje NAD+ na NADH a sleduje se nárůst absorbance při 340 nm,
která je přímo úměrná koncentraci takrolimu. Endogenní
glukóza-6-fosfátdehydrogenáza neinterferuje, protože NAD+ reaguje
s bakteriálním enzymem použitým v soupravě. Rozsah metody 2,6 – 39
nmol/l. Analytická citlivost 2,6 mmol/l, funkční citlivost 3,64 µg/l.
Preciznost CV v sérii 3,4 – 7,8 %, celkem 6,8 – 16,4 %; výtěžnost 106 –
110 %.
CEDIA je homogenní enzymová
imunoanalýza, která využívá rekombinantní DNA technologie, kdy donor a akceptor
enzymu po spojení vytvoří aktivní β-galaktosidázu, která reaguje
s galaktopyranosidovým substrátem za vzniku barevného produktu. Takrolimus
ze vzorku a takrolimus značený donorem soutěží o specifickou protilátku.
Protilátka vůči takrolimu zabraňuje vzniku aktivního enzymu (spojení donoru
s akceptorem). Čím více je takrolimu ve vzorku, tím více konjugátu donoru
enzymu s takrolimem zůstane ve volné formě a může se spojit
s akceptorem na aktivní enzym, takže výsledná absorbance je přímo úměrná
množství takrolimu ve vzorku. Analytická citlivost byla 1,04 nmol/l. Rozsah
metody je do 39 nmol/l. Preciznost měla CV 6,3 – 20,6 %, výtěžnost 100 – 112,2
%.
MEIA postupu předchází úprava
vzorku krve extrakčním činidlem (síran zinečnatý v metanolu a
etylenglykolu) a odstředění. Supernatant se pipetuje do jamky a přidají se
mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči takrolimu a poté
konjugát takrolimu s ALP. Dochází k soutěži takrolimu ze vzorku a
z konjugátu o vazebná místa na specifické protilátce. Reakční směs se
převede na fritu ze skleněných vláken, kde se mikročástice zachytí. Substrát se
ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem
vymyje volný takrolimus z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha
s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je
fluorochrom. Intenzita fluorescence (excitace 485, emise 525 – 550 nm) je
nepřímo úměrná koncentraci takrolimu ve vzorku a je měřena fluorimetrem.
Analytická citlivost 1,97 nmol/l. Rozsah metody do 39 nmol/l. Preciznost
v sérii dosahuje CV celkem 5,4 – 17,4 %, přesnost +3 až +27 %; výtěžnost
84 – 97 %.
Před zahájením chemiluminiscenční analýzy je
vzorek krve extrahován precipitačním činidlem (roztok síranu zinečnatého
v metanolu a etylenglykolu) a odstředěn. Supernatant se použije pro chemiluminiscenční analýzu s esterem akridinu jako značkou. Principem stanovení je sekvenční imunoanalýza.
Supernatant se smíchá s EDTA pufrem a paramagnetickými mikročásticemi
potaženými myší monoklonální protilátkou vůči takrolimu. Obsadí se část
vazebných míst specifické protilátky a poté se do reakční směsi přidá konjugát
takrolimu s esterem akridinu v citrátovém pufru, který obsadí zbylá
dostupná vazebná místa na mikročásticích. Po inkubaci se mikročástice promyjí
fosfátovým pufrem a do reakční směsi se přidají roztoky peroxidu vodíku a
hydroxidu sodného. Množství takrolimu ve vzorku je nepřímo úměrné
chemiluminiscenci. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat
s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích. Vzorky od pacientů, kteří
jsou běžně vystaveni kontaktu se zvířaty nebo s produkty ze zvířecího séra,
mohou být k této interferenci náchylné a mohou u nich být naměřeny anomální
hodnoty. Vzorky od pacientů, kterým byly z diagnostických nebo terapeutických
důvodů aplikovány preparáty obsahující myší monoklonální protilátky, mohou
obsahovat lidské anti-myší protilátky (HAMA). Vzorky obsahující HAMA mohou
poskytovat anomální hodnoty. Rozsah metody 2,6 –
39 nmol/l. Analytická citlivost 0,39 nmol/l, funkční citlivost 2,6 nmol/l.
Preciznost CV v sérii 2,4 – 5,0 %, celkem 3,5 – 6,7 %. Odezva na linearitu
byla 98 – 108 %. Výtěžnost byla 98 – 107 %.
HPLC/MS/MS s elektrosprejí předchází předběžná úpravy deproteinací síranem
zinečnatým a následná extrakce do acetonitrilu a poté izokratická
chromatografie na koloně, kdy je vzorek vymýván mravenčanem amonným
v metanolu (+0,1 % kyseliny mravenčí). Detekuje se primární ion m/z
Mezinárodní standard oficiálně neexistuje i když jeden
čínský výrobek nese označení standardní referenční materiál a k dispozici
jsou preparáty s čistotou > 99 %.
Interference
Výsledky stanovení takrolimu snižuje: ethotoin, fenobarbital, fenytoin,
karbamazepin, mefenytoin, primidon,
rifabutin, rifampin, trimethoprim-sulfa (intravenózně), aj.
Výsledky stanovení takrolimu zvyšují: bromokriptin, cimetidin, cisaprid,
cyklosporin, danazol, ditiazem, erythromycin, flukonazol, itrakonazol,
klarithromycin, ketokonazol, klotrimazol, methylprednisolon, proteázové
inhibitory, metoklopramid, nikardipin, nifedipin, troleandomycin, verapamil,
aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15