Stanovení lipoproteinu (a)
Lp(a)
Synonyma
lipoprotein (a), lipoproteinový antigen, lipoprotein-a, LPA
Preanalytická fáze
Odebírat po 12 h lačnění. Stabilizace přídavkem thiomersalu.
Stabilita: 20 – 25
°C 24-48 h, 4 – 8 °C 7-15 dní, -20 °C 4-12 týdnů.
Stanovení se provádí v séru nebo plazmě
(antikoagulans EDTA nebo citran).
Stanovení
ovlivňuje poloha (pozice vsedě – výsledky nižší), dieta, rasa a opakované
zamrazení. Při vědomí relativní stálosti plazmatických hladin Lp(a) stačí
kvantitativní vyšetření provést u každého jedince pouze jednou za život.
Poznámky k analytické metodě
Velmi významným a
charakteristickým rysem Lp(a) je jeho heterogenita.
Lp(a) lze
prokázat při určitém uspořádání běžnou elektroforézou lipoproteinů na agaróze jako
samostatný pás, semikvantitativně protisměrnou elektroforézou nebo
imunochromatografií. Kvantitativní stanovení hladiny Lp(a) se provádí
imunochemickými metodami; při nedostatečné standardizaci je však velkým
problémem vzájemná porovnatelnost naměřených údajů.
Radiální imunodifuze je jednoduché
stanovení, které nevyžaduje ředění vzorků; lze použít jak polyklonálních, tak
směsi monoklonálních protilátek. Stanovení je časově náročné a nepoužitelné pro
velké série. Analytická citlivost je nízká a rozdílná vůči různým velikostem
částic Lp(a) (menší nadhodnoceny, větší podhodnoceny).
Elektroimunodifuze koreluje dobře s citlivějšími technikami (např. ELISA); lze použít polyklonálních protilátek.
Stanovení je časově náročné a nepoužitelné pro velké série. Analytická
citlivost je nízká. Rozsah metody je 84 – 580 mg/l.
Imunonefelometrické
a imunoturbidimetrické metody jsou rychlé, jednoduché
a nejméně náročné pro laboratoře co do technického vybavení (turbidimetrie).
Reprodukovatelnost je dobrá; lze je snadno automatizovat a mají dobrou korelaci
s RIA, IRMA, ELISA metodami. Latexová aglutinace může eliminovat nespecifickou
precipitaci, protože zejména imunonefelometrie je vysoce sensitivní k
rozdílnostem ve velikosti Lp(a) částic. Senzitivita není jasně definovaná,
protože různé sérové matrice mohou stanovení nespecificky ovlivnit. Pro
imunoturbidimetrii je reprodukovatelnost CV v sérii 1,6 – 5,5 %, mezi
sériemi 2,8 – 10,7 %. Při kinetické nefelometrii byl limit detekce 10 mg/l,
rozsah metody 10 -1280 mg/l, reprodukovatelnost CV v sérii 1,0 – 2,1 %,
mezi sériemi 1,5 – 6,9 %.
RIA a IRMA jsou vysoce sensitivní, lehce automatizovatelné a s dobrou
reprodukovatelností.
Kalibrace
mají omezenou dobou použití a měření probíhá v duplikátu.
Reprodukovatelnost IRMA CV < 5 %.
ELISA je dosud nejpoužívanější technika stanovení Lp(a), nejčastěji
v sendvičovém uspořádání. Metoda je vysoce sensitivní, lehce
automatizovatelná a s dobrou reprodukovatelností. Výsledek závisí na detekčním
záchytném systému. ELISA se provádí buď s monoklonálními protilátkami
proti jednotlivým epitopům lipoproteinu(a) nebo sendvičová ELISA s kotvící
protilátkou vůči lipoproteinu(a) a signální protilátkou proti Apo B. Značkou je
obvykle peroxidáza, substrátem tetrametylbenzidin a detekce se provádí při 405
nm. Repreodukovatelnost CV v sérii 4 – 6 %, mezi sériemi 7 – 9 %. Detekční
limit je < 50 mg/l. Rozsah metody do 600 mg/l.
DELFIA je
v sendvičovém provedení s kotvící protilátkou proti Lp(a) a druhou
protilátkou proti Lp(a), značenou Eu3+ ve formě chelátu s N1-(p-izothiokyanatobenzyl)-dietylentriamin-N1,N2,N3,3-tetraoctovou
kyselinou. Fluorescence se detekuje při 280 nm. Reprodukovatelnost CV
v sérii 2,7 – 7,1 %, mezi sériemi 7,1 – 15,0 %, výtěžnost 93,8 – 106,7 %.
Detekční limit je 2,5 mg/l a rozsah metody do 1900 mg/l.
Imunobloting na
nitrocelulózové membráně. Membrána byla následně inkubována s myší
monoklonální protilátkou proti Lp(a) a po promytí s druhou kozí anti-myší
protilátkou značenou ALP. Vybarvení se provedlo v nitrotetrazoliové modři
a 5-brom-4chlor-3-indoyl-fosfátu.
Reprodukovatelnost metody dosáhla CV 5 – 8 %.
Hlavní zvláštnosti imunochemického stanovení Lp(a) jsou: vysoký stupeň
homologie Lp(a) a plazminogenu, výrazný polymorfismus jednotlivých izoforem
Lp(a) s výraznými odchylkami co do velikosti molekuly (93% evropské populace
představují heterozygoti s kombinací malých a velkých izoforem) a distribuce Lp(a) v séru mezi
frakcemi lipoproteinů o rozdílné hustotě.
je třeba zohlednit citlivost příslušné metody na izoformy Lp(a).
Při imunochemickém
stanovení koncentrace lipoproteinu Lp(a) lze narazit na řadu problémů: jak
kalibrovat, výběr vhodné protilátky a volba metody, která by neměla být závislá
na polymorfismu Lp(a).
Je také možné
separovat ostatní lipoproteiny ultracentifugací a pak stanovit
cholesterol v Lp(a).
Intraindividuální
variabilita je 8,5 – 26,7 %, interindividuální variabilita až 85 %.
Standardizace dosud není. Neexistuje standardizační
protokol pro izolaci částic Lp(a), byly zkoušeny různé techniky - všechny jsou
velmi problematické. Referenční interval závisí na použité metodě.
Tolerační rozmezí EKK je 40 %
Výsledky stanovení lipoproteinu (a) snižují: aferéza,
etanol, cvičení, hemodialýza (diabetická nefropatie), IGF-I, IL-3, intralipid,
kouření, lipémie, obezita, opakované zamražení, plazmaferéza, rybí olej, ztráta
hmotnosti, aj.
Výsledky
stanovení lipoproteinu (a) zvyšují: česnek, hemodialýza (chronické renální
selhání), kouření, menopauza, peritoneální dialýza, puberta, rodové dispozice,
růstový hormon, těhotenství, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15