Stanovení transferinu deficitního na
sacharidy (CDT)
Synonyma
CDT, carbohydrate deficient-transferrin
Preanalytická fáze
Sérum je stabilní 4 h – 30 h
při laboratorní teplotě, 7 dní při 4 – 8 °C
a 3 měsíce – 8 let při ‑20° C. Jsou-li vzorky skladovány 3 dny za
laboratorní teploty zvýší se koncentrace CDT o 25%. Vzorky by měly být
analyzovány ihned po rozmrazení. EDTA a heparin mohou narušit saturaci Fe3+
in vitro. Silná hemolýza falešně zvyšuje výsledky. Denní intraindividuální
fluktuace je 8 – 10 %. Biologický poločas
je 9,5 dne.
Poznámky k analytické metodě
Koncentrace transferinu
deficitního na sacharidy se sleduje u alkoholiků. Specifické reakce nebo protilátky
vůči CDT nejsou dostupné.
Analýza CDT v séru vyžaduje oddělení
CDT od ostatních složek sérové matrice a od izoforem, které nejsou deficitní na
sacharidy. To se dosahuje chromatografickými metodami, jako je
aniontově-výměnná chromatografie (HPLC detekce při 460 nm nebo kompetitivní
RIA), nebo elektroforetickými metodami, např. izoelektrickou fokuzací, kdy se
s výhodou využívá rozdílného náboje a pI mezi CDT a ostatními izoformami
(detekce imunofixací nebo densitometrií nebo imunoblot). Protože imunoelektroforéza má vysokou
selektivitu, používá se jako referenční metodapro analýzu izoforem transferinu
v séru. Další aplikované metody jsou HPLC, kapilární zónová elektroforéza,
kompetitivní imunoanalýza, chromatofokuzace a imunoafinitní kapalinová
chromatografie s elektrosprejí při hmotnostní chromatografii. CDT analýza
obvykle začíná saturací Fe3+ in vitro, aby se dosáhlo jednotné
obsazení transferinu železem. Tento krok je nutný, aby se omezil počet izoforem
transferinu v séru zamezilo se výskytu CDT a ostatních izoforem při
stejném pI. Bez ohledu na to jaký separační postup a způsob analýzy se použijí
je úplné a trvalé nasycení transferinu železem absolutně nutné ke spolehlivému
stanovení CDT.
Dříve používané metody k měření CDT byly pracné a nebyly vhodné pro
rutinní analýzu.
Byla také popsána poloautomatická turbidimetrická metoda ke
stanovení CDT. Tato metoda částečně separuje CDT ze vzorku a pak ho stanoví
imunoturbidimetricky na mikrotitrační destičce. Reprodukovatelnost je CV
v sérii 4,8 – 7,2 %, mezi dny 7,0 – 8,6 %.
Nefelometrický postup je založen na použití monoklonálních protilátek,
rozeznávajících glykoformy transferinu. Kompetitivní imunoreakce probíhá na
polystyrenových částicích a detekci je možné provést po 18 min.
Reprodukovatelnost je CV v sérii 2,6 – 7,0 %, celková reprodukovatelnost
3,4 – 10,4 %.
Další komerčně dostupná metoda používá dvou protilátek pro RIA.
Po saturaci vzorku železem jsou separovány izoformy transferinu anexové koloně
a CDT frakce v eluátu jsou stanovené v duplikátu kompetitivní RIA.
Reprodukovatelnost CV v sérii 4 – 5 %, celková reprodukovatelnost 5,5 %.
Lze také využít principu enzymové imunoanalýzy.
CDT lze také stanovit izoelektrickou fokuzací na
polyakrylamidovém gelu. Sérum je částečně nasyceno železem a analyzováno
izoelektrickou fokuzací na polyakrylamidovém gelu obsahujícícm gradient
amfolytů. Tak se separují jednotlivé izoformy a jednotlivé pásy transferinu
jsou detekovány imunoblotem pomocí kotvící králičí protilátky vůči lidskému
transferinu a následně konjugátem ALP s králičí IgG protilátkou.
Absorbance pásů je měřena laserovou densitometrií. CDT je stanoven
v poměru k transferinu. Stejný postup lze použít také k rozlišení
alelických D-variant transferinu od CDT.
Kromě toho byla popsána kapilární elektroforéza a kapilární zónová
elektroforéza pro stanovení CDT. Používají se křemenné kapiláry bez
stacionární fáze. Selektivita a senzitivita je ale nižší než u izoelektrické
fokuzace.
Plně
automatizovaná iontově-výměnná HPLC metoda umožňuje stanovení
v séru po saturaci železem, přičemž jsou lipoproteiny vysráženy
dextransulfátem a odstraněny centrifugací. Supernatant se naředí vodou a
převede do automatického nastřikovacího zařízení. Deficientní izoformy
transferinu v kyselině sialové s pI 5,7 – 5,9 jsou rozděleny na iontoměničové
koloně v solném gradientu. Píky transferinu se detekují spektrofotometricky při
460 nm a změří se jejich plocha. Analýza trvá 32 min, včetně regenerace kolony.
Reprodukovatelnost CV v sérii 2,3 – 7,0 %, mezi dny 5,7 - 16 %.
Mikrochromatografické techniky mají pro CDT senzitivitu 81 – 94 % a specificitu
91 – 100 %.
Byla také popsána afinitní chromatografie
s lektinem na Sepharosové koloně.
Imunoafinitní kapalinová chromatografie
s elektrosprejí při hmotnostní chromatografii má
reprodukovatelnost CV v sérii 9,3 %, mezi sériemi 10 %. Analýza trvá méně
než 10 min a je automatizovatelná. Korelace s izoelektrickou fokuzací i
afinitní chromatografií je dobrá.
Preciznost běžných CDT testů je 10 %. Standardizace analýzy
s použitím mezinárodního standardu nebyla ještě v roce 2010
provedena. Jako referenční metoda je
uvažována HPLC-MS.
Výsledky stanovení CDT zvyšují: anabolické
steroidy, androgeny, edecrin,
estrogeny, etanol (zvláště u žen),
hemodialýza, hemolýza, lipémie, parenterální výživa, prednisolon, aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15