Stanovení kreatininu
Synonyma
1-methylhydantoin-2-imid,
1-methylglykocyamidin,
2-amino-1-methyl-4-imidazolidinon, 2-imino-1-methylimidazolidin-4-on
2-amino-1,5-dihydro-1-methyl-4H-imidazol-4-on
Preanalytická
fáze
Stanovení se provádí
v séru, plazmě a moči. Koncentrace kreatininu v séru a plazmě
(antikoagulanty heparin nebo EDTA) je stejná. Pro enzymové metody, kde vzniká
amoniak nelze použít jako antikoagulans heparinát amonný. Kreatinin je stabilní
při opakovaném zamrazení a rozmrazení séra. Před vyšetřením není
vhodná dieta s vyšším obsahem mastných bílkovin (maso, vývary) nebo větší
fyzická zátěž. Hodnoty jsou ovlivněny věkem, svalovou hmotou a pohlavím.
Moč je sbíraná do
plastových lahví (polystyrén) bez konzervačních látek a po dobu sběru se
doporučuje skladovat odběrové nádoby v lednici. Před odlitím vzorku je
nutno střádanou moč řádně promíchat, změřit objem s přesností na 10 ml (u
velmi malých dětí s přesností na 1 ml); uvést přesně dobu sběru. Důležitý je kvantitativní sběr moči. Některé léky
(salicyláty, cimetidin, trimethoprim) interferují s tubulární exkrecí
kreatininu a ovlivňují tak hodnoty jeho clearence.
Kreatinin je stabilní 24 h za
laboratorní teploty nad krevní sraženinou. Maximální doporučený čas od získání
do zpracování vzorku je 4 h při doporučené teplotě 20°C. Stabilita: 18 - 26 °C
sérum nebo plazma: 3 dny, moč 2 dny; 4 – 8 °C sérum nebo plazma: alespoň 7 dní
moč 4 – 6 dní; -20 °C 1 rok sérum, plazma a moč půl roku.
Poznámky
k analytické metodě
Ke stanovení kreatininu se používají metody
s alkalickým pikrátem, plně či částečně enzymové metody, HPLC metody a ID + MS.
Jaffeho metoda z roku 1886
se dosud běžně používá v rutinních laboratořích. Interferující látky,
zvláště bílkoviny při jejím použití mohou falešně zvýšit výsledky až o 15 -25
%. Interference glukózy a acetoacetátu je zvláště významná, protože diabetici
jsou skupinou s vysokým rizikem vzniku chronických nefropatií.
Reakci ovlivňují: koncentrace reaktantů, pH,
vlnová délka měření, teplota, časový interval měření a interferující látky. Při
reakci kreatinin s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí tvoří
Janovského komplex při běžných koncentracích kreatinin-pikrát 1:1, při vysokých
koncentracích analytu kreatinin-pikrát 2:1. Reakce je pseudoprvního řádu do 30
mmol/l a při koncentracích nad 6 mmol/l má nelineární počáteční rychlost. Vyšší pH vede k rychlejší
reakci a současně k rychlejšímu rozkladu Janovského komplexu, takže roste
absorbance blanku. Janovského komplex
je málo citlivý na snížení pH. Maximální zbarvení reakčního produktu se
dosahuje při pH 12,5. Použití pufrů vyvolává chelataci interferentů. Fosfátové
pufry (136 až 173 mmol/l) zajišťují pH 9,65 až 11,50. Použití blanku je
užitečné pro eliminaci většiny interferencí. Absorbance se měří při < 515 nm. Maximum absorbance je při
490 – 520 nm, přičemž při 510 – 520 nm
je snížená absorbance blanku. Vyšší koncentrace hydroxidu vede bathochromnímu
posunu. Detekce při 235 nm je také možná, ale nemá žádné přednosti. Zvýšení
teploty vede ke vzrůstu absorbance Janovského komplexu a blanku. Reakční
rychlost je vyšší o 30 – 60 % / 10 °C. Vyšší teplotní stabilita blanku je při > 510 nm. Nižší vlnové délky
jsou citlivější na termochromní odezvu a mají tedy vyšší hodnotu blanku.
Počátek měření má být alespoň 10 s od startu reakce, konec přibližně po 80 s,
ačkoliv některé postupy počítají s měřením až do 120 s. Kinetické měření
má trvat alespoň 20 s, ale kinetický režim kvalitu analýzy významně nezlepší,
např. interference bilirubinu zůstává.
Při Jaffeho reakci interferují: bílkoviny,
ketony, ketokyseliny, glukóza, bilirubin, některé léky, mastné kyseliny,
vitamin C a další látky. Bílkoviny
neruší do 90 s od startu reakce
a 120 s od startu způsobuje 70 g/l albuminu interferenci +5 až 10 µmol/l
kreatininu. Laurylsíran sodný snižuje interferenci bílkovin. Aceton vyvolává interference od 8
mmol/l v séru, ale mezi 10.-109. s neruší do 10 mmol/l v séru. Je-li
aceton v moči do 5 mmol/l, pak
při koncentraci kreatininu 1 mmol/l je
chyba +97 %, ale při koncentraci kreatininu 8 mmol/l jen +0,4 %. Acetoacetát interferuje
od 0,25 mmol/l. Interference do 60 s: 1 mmol/l acetoacetátu odpovídá 10 µmol/l
kreatininu, 8 mmol/l acetoacetátu 100 – 310 µmol/l kreatininu. Interference se už neprojeví mezi 60. až 120.
s. Glukóza do 50. s neruší ani v koncentraci 85 mmol/l, mezi 60. – 120. s
50 mmol/l glukózy odpovídá negativní interferenci -8 µmol/l kreatininu.
Koncentrace bilirubinu 250 µmol/l odpovídá -44 µmol/l kreatininu a interferenci
lze odstranit přídavkem ferokyanidu draselného. Z léků nejvíce ruší
cefalosporiny (10 mmol/l odpovídá +500 µmol/l kreatininu), ale také: fenacemid,
sulfonylmočovina, acetohexamid. Mastné kyseliny v koncentraci 0,4 mmol/l
odpovídají +300 µmol/l kreatininu. Kyselina askorbová dává falešně nízké
výsledky, protože částečně redukuje pikrát na pikramát.
Standardizovaný
postup Jaffeho metody je E.P. bez deproteinace, s inkubací 20 min, poměrem
sérum – činidlo 1:5 a koncentrací kyseliny pikrové 10,5 mmol/l.
Specifitu Jaffeho
reakce může zvýšit fenolický derivát floridin, na který se adsorbuje kreatinin
po deproteinaci vzorku. Podobné vlastnosti má Lloydovo činidlo (křemičitan
hlinitý) nebo bentonit (čedičová hornina). Všechny tyto látky jsou porézní
hlíny s velkou adsorptivitou (za 1 min adsorbují 92 % kreatininu). Po
centrifugaci a dekantaci lze přidat alkalický pikrát přímo k peletám
adsorbentu. Při tomto postupu ruší pouze pyruvát v přebytku 0,9 mmol/l a
2-oxoglutarát v přebytku 0,5 mmol/l. Podobnou purifikaci lze provést na sodné
katexové pryskyřici v kyselém prostředí.
Intralaboratorní
CV při koncentraci 88,4 µmol/l je v intervalu 1,8 až 7,5 µmol/l. Vychýlení
proti GC-IDMS je v intervalu -5,3 až +27 µmol/l. Interferující látky při
Jaffeho metodě způsobují zvýšení výsledků o 20 % v plazmě a séru, resp. +5
% v moči.
Další fotometrické
metody využívají reakce s 1,4-naftochinon-2-sulfonátem nebo
o-nitrobenzaldehydem. Mez detekce je 18 µmol/l.
Enzymové metody stanovení kreatininu mají obecně nižší interference než Jaffeho metody, ale
i zde byly popsány interference zejména vlivem: bilirubinu, hemoglobinu,
monoklonálního IgM a některých léčiv.
Hlavní enzymová
metoda začíná přeměnou kreatininu na kreatin katalyzovanou kreatinin
amidohydrolázou. Následně se kreatin fosforyluje ATP za katalýzy kreatinkinázou
na kreatinfosfát. Vzniklý ADP reaguje se zpětně fosforyluje fosfoenolpyruvátem
za katalýzy pyruvátkinázou. V detekčním kroku se pyruvát
v oxidoredukční reakci redukuje na laktát a současně se oxiduje NADH na
NAD+ za katalýzy laktát dehydrogenázou. Reprodukovatelnost
v sérii je CV 2,3 – 5,6 %, mezi dny 5,7 – 7,8 %. Ve srovnání
s uvedenou enzymovou reakcí poskytuje Jaffeho postup výsledky při
koncentraci kreatininu 22 – 88 µmol/l +
20 až 50 % a při koncentraci kreatininu 89 – 177 µmol/l + 10 až 30 %.
Další enzymová
metoda má identický první stupeň jako hlavní enzymová metoda. Následně se
kreatin rozkládá kreatinázou na močovinu a sarkosin, který se oxidačně
demetyluje na glycin, formaldehyd a peroxid vodíku. K detekci slouží
Trinderova reakce peroxidu vodíku se 4-aminoantipyrinem a fenolem, katalyzovaná
peroxidázou. Mezidenní reprodukovatelnost byla 6,1 %, výtěžnost 96,1 %.
V hemolytických sérech jsou výsledky o 4 – 10 % vyšší. Metoda není vhodná
pro lipemická a ikterická séra. Jinou alternativou koncové reakce je využití
formaldehydu, kdy se oxiduje pomocí NAD+ v přítomnosti
formaldehyd dehydrogenázy na kyselinu mravenčí a sleduje se při 340 nm nárůst
redukovaného NADH.
Třetí postup
začíná hydrolýzou kreatininu kreatinin iminohydrolázou na N-metylhydantoin a
uvolněný amoniak (lze ho detekovat také amonnou elektrodou) reaguje
v oxidoredukční reakci s kyselinou 2-oxoglutarovou na kyselinu
glutamovou a současně se oxiduje NADPH na NADP+. Reprodukovatelnost
mezi dny CV 3,4 – 10,0 %.
Při reflexní
fotometrii se využívá reakce kreatininu s kyselinou
3,5-dinitrobenzoovou, kdy vzniká purpurově-červený komplex (fotometrie při 560
nm). Tento postup umožňuje detekci již po 30 s při 560 nm
s precizností 11,3 % při koncentraci 100 µmol/l.
Druhý postup začíná výše uvedenou enzymovou reakcí: tj. hydrolýzou kreatininu
kreatinin iminohydrolázou na N-metylhydantoin a uvolněný amoniak, které pak
reaguje s bromfenolovou modří a reakce se sleduje při 600 nebo 670 nm. Při
reakci interferuje sérový amoniak, který je nutno stanovit paralelní reakcí bez
kreatinin imidohydrolázy.
K dispozici
je více než 50 postupů stanovení HPLC kationově-výměnné chromatografie a
chromatografie na normální nebo reverzní fázi. Přestože deproteinace
představuje zvýšení specifity, jsou popsány i techniky bez deproteinace. HPLC
je nejlepší z běžně dostupných metod ke stanovení kreatininu a specifitou
předčí i enzymové metody. Separace se provádí na katexu jako stacionární fázi
s citrátovým pufrem (pH 4,25) jako mobilní fází.
Jiný postup
používá kolonu s reversní fází a mobilní fází je pufr fosfát–laurylsíran
sodný–metanol (pH 5,1). Detekce se provádí po Jaffeho reakci, nebo se detekuje
přímo kreatinin při 200 nm. Oba postupy jsou rychlé, specifické a mají vysokou
preciznost.
Jako referenční
postupy jsou uvedeny tři GC-IDMS metody. Všechny vyžadují
derivatizaci kreatininu (vzhledem k jeho polaritě) a následné odstranění
kreatinu (separace na katexu); jsou časově náročné. GC-IDMS má vynikající
specifitu a SD < 0,3 %.
LC-IDMS metoda (rok 2003) je jednodušší a rychlejší (nevyžaduje derivatizaci,
ale deproteinace zůstává); nebyla uznána jako referenční (ačkoliv vychýlení
< 0,2 %), přestože se používá paralelně s referenčními metodami.
Doporučené rutinní
metody stanovení: enzymové metody, HPLC, Jaffeho metoda bez deproteinace. Pro
pacienty na hemodialýze a v transplantačních programech se doporučuje
používat enzymovou metodu. Nedoporučené
metody: Jaffeho metoda s deproteinací.
Standardní
referenční materiál NIST 914a je krystalický kreatinin a používá se pro
kalibraci GC-IDMS a LC-IDMS.
Standardy NIST
909b-1, 909b-2, BCR: 573, 574, 575 jsou lyofilizovaná lidská séra různých
koncentrací s certifikovanou koncentrací kreatininu metodou GC-IDMS. Při
lyofilizaci je změněna jejich matrice a nejsou tedy komutabilní
s nativními séry při použití rutinních analytických metod.
SRM 967 jsou
čerstvá zmrazená séra podle směrnice C-37A Clinical and Laboratory Standards
Institute. Referenční materiály byly připraveny spoluprací několika institucí
v roce
Zpráva College of
American Pathologists z roku 2001 uvádí preciznost CV 2,5% až 6,0% při
koncentraci 177 µmol/l. Akceptovatelná kritéria kvality laboratoře (CLIA-88)
pro kreatinin jsou ±26,5 µmol/l nebo ±15% (podle toho, co je vyšší).
Intraindividuální variace sérového kreatininu u zdravých dospělých je 4 – 6 %.
Z toho odvozená hodnota pro preciznost je 2,2 % a celková chyba stanovení
≤ 6,9 %.
Toleranční limit EHK:
15 %
(sérum, plazma), 24 % (moč); CV pro vnitřní
kontrolu kvality: 5 %.
Teoretický toleranční
limit: 7,9 %.
Interference
Koncentraci kreatininu v plazmě a séru
snižují: acetoacetát, bakteriální kontaminace (zpomalení Jaffeho reakce),
bilirubin, citrát, dopamin (enzymové metody), EDTA, etanol, fluorid,
hemodialýza, hemoglobin, IGF 1, intralipid, kreatin, oxalát, sarkosin,
těhotenství (zejména 1. a 2. trimestr), triacylglyceroly > 28 mmol/l,
vegetariánská dieta, žlučové soli, aj.
Koncentraci kreatininu v plazmě a séru
zvyšují: acetoacetát, aceton, amikacin, amikin, aminohippurát, arginin,
bílkoviny, cefalosporiny, cimetidin, cvičení, cyklosporin, dehydratace, dopamin
(Jaffeho metody), erytropoetin, 5-flucytosin, fluoridy, 5-fluorocytosin,
framykoin, fruktóza, gentamycin, glukóza, glutamin, guanidin, hladovění, hydantoin,
hydroxybutyrát > 1 mmol /l, interleukin-2, kyselina acetoctová, kyselina
močová, laktulóza, levulóza, manit, metyldopa, oxalacetát, pyruvát, růstový
hormon, vitamin C, proteinová dieta, těhotenství (4. – 9. měsíc), trimecrytron, trimethoprim, tymol,
urandil, aj.
Koncentraci kreatininu v moči snižují:
běloba, čokoláda, detergenty, etanol, fosforečnan draselný, fluorescein,
kofein, malnutrice, vegetariánská dieta, aj.
Koncentraci kreatininu v moči zvyšují:
aceton, asparagin, cvičení, etanol, histidin, indol, kyselina hippurová,
kyselina homogentisová, kyselina pyrohroznová, spasmoveralgin, superanabolon,
těhotenství (od 4. týdne), aj.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-15