Stanovení natriuretického peptidu typu B
(N-terminálního, NT-proBNP)
Synonyma
NT-proBNP, N-terminal pro-brain natriuretic
peptide
Preanalytická fáze
Stanovení se provádí v séru nebo raději
v plazmě (heparinát amonný nebo lithný; v případě
použití K3EDTA jsou výsledky systematicky o 10 % nižší). Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 2 h při
doporučené teplotě 20°C. Klid na lůžku před odběrem není nutný.
Stabilita (plazma, sérum): 18
– 26 °C 6 h, 2 – 8 °C 3 dny, -20° C 6 – 12 měsíců. Nemohou být použity vzorky stabilizované azidem. Vzorky
obsahující sraženinu musí být centrifugovány. Před analýzou je třeba vzorek
vytemperovat na laboratorní teplotu.
Stanovení není ovlivněno
ikterem, hemolýzou, chylozitou. Při koncentraci 33,4 nmol/l se ještě neprojevuje
efekt nadbytku antigenu.
Stanovení NT-proBNP se
provádí imunochemicky soupravami nebo jednoúčelovými kazetami.
ELISA je založena na
kompetitivním principu, kdy o čistěnou polyklonální ovčí protilátku specifickou
vůči NT-proBNP (vázanou na mikrotitrační destičce) soutěží peptid ze vzorku a
peptid značený křenovou peroxidázou. Po odstranění volné frakce se přidá
substrát tetrametylbenzidin a barevná změna po zastavení reakce s peroxidázou
se sleduje fotometricky. Mez stanovitelnosti: 5,9 pmol/l (CV £ 20 %). Linearita metody je v rozsahu 2,36 – 2950
pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 1,5 – 2,8 %, mezi sériemi 3,4 –
5,1 %, mezi šaržemi 3,5 – 8,4 %. Klinická senzitivita: 91,9 %; klinická
specifita: 92,9 %.
Princip kompetitivní ELISA může být i mnohem
složitější, kdy je protilátka navázaná na oxidu chromičitém a druhá protilátka
označená ALP. Kaskáda enzymových reakcí přes prolinoxidázu a křenovou
peroxidázu končí Trinderovou reakcí. Mez detekce je 0,24 pmol/l. Celková
reprodukovatelnost byla 2,6 – 14,7 % a výtěžnost 98,4 – 104,7 %.
Chemiluminiscence je založena na
sendvičovém principu. Kuličky jsou potaženy ovčí polyklonální protilátkou vůši
NT-proBNP a druhá protilátka je značená ALP s telecího střeva. Po separaci
imunokomplexu se sleduje chemiluminiscence vznikající rozkladem substrátu
adamantyldioxetanfenylfosfátu ALP. Kalibrační
rozsah metody je 2,4 – 4 130 pmol/l, analytická citlivost 1,2 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii
byla CV 2,3 – 5,4 %, celková 4,0 – 6,4 %; linearita 97 – 121 %, výtěžnost 92 –
131 %.
Chemiluminiscence může používat také kompetitivní
postup, kdy je protilátka v mikrotitrační jamce vázána
streptavidin-biotinovým můstkem. O její vazebná místa soutěží NT-proBNP ze
vzorku a konjugát NT-proBNP s křenovou peroxidázou. Po separaci volných
reaktantů se sleduje luminiscenční reakce s luminolem. Reprodukovatelnost
v sérii byla CV 0,7 – 1,3 %, mezi kalibracemi 1,7 – 6,0 %, mezi
laboratořemi 1,8 – 5,5 %; výtěžnost 94,8 – 97,2 %.
Elektrochemiluminiscence používá dvou
polyklonálních ovčích protilátek. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou ovčí
polyklonální protilátkou, specifickou vůči N-terminální frakci BNP (NT-proBNP)
a ovčí polyklonální protilátkou, specifickou vůči NT-proBNP značenou
ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový imunokomplex. Pak se přidají
mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou
biotinylovou kotvou.
Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se
mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se
odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá
chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. U pacientů, kteří dostávají
vysoké dávky biotinu (např. > 5 mg/den), mohou být vzorky odebrány nejdříve
za 8 hodin po podání poslední dávky biotinu. Linearita metody je v rozsahu 0,59
– 4130 pmol/l. Mez detekce je 0,6 pmol/l (2 SD), mez stanovitelnosti: 5,9
pmol/l (CV £ 20 %).
Reprodukovatelnost v sérii byla CV 1,8 – 2,7 %, mezi sériemi 2,2 – 3,2 %.
Klinická senzitivita: 88 %; klinická specifita: 92 %.
Na principu fluorescenční detekce se také
používají také jednoúčelové kazety. Při hodnocení na fluorimetru je mez detekce
2,1 pmol/l, mez stanovitelnosti: 6,7 pmol/l (CV £ 20 %).
Reprodukovatelnost v sérii CV 5,5 – 9,4 %, mezi dny 8,9 – 10,3 %.
HPLC
má čistě výzkumný charakter. Na reverzní fázi s acetonitrilem jako mobilní
fázi byl použit vnitřní standard rekombinantní lidský NT-proBNP1–37–NT-proANP29–98.
Reprodukovatelnost v sérii byla CV 4,7 – 6,0 %, mezi sériemi 10 – 12 %;
výtěžnost byla 91,7 – 97,7 %.
Doporučená metoda ani certifikovaný materiál nebyly
ještě v roce 2010 k dispozici.
Tolerační rozmezí EKK je 30 %.
Interference
Bilirubin může interferovat se stanovením NT-proBNP u vzorků nižších
než 59 pmol/l; způsobuje snížení hodnot.
Další informace
Petr Štern, 2011-02-28