Stanovení myoglobinu

Synonyma

nejsou

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí v obvykle v séru, plazmě nebo moči. Jako antikoagulans lze použít heparin nebo EDTA, ale výsledky z EDTA plazmy jsou nižší (7 – 13 %). Použití separačního gelu snižuje výsledky o 20 až 31 %. Biologický poločas 10 – 20 min.

Stabilita: 18 – 26 °C 8 h (sérum), 2 – 8 °C 1 týden (sérum) a 24 h (moč), -20° C 4 týdny (sérum). V celé krvi po 1 h začíná koncentrace klesat. Stabilita v moči při pH 8 – 9,5 je 12 dní. Vzorky moče nezamrazovat. Sbíranou moč je třeba před analýzou centrifugovat.

Stanovení ruší lipémie.

Poznámky k analytické metodě

Při detekci se používají spektrofotometrické, elektroforetické nebo chromatografické metody a také lze použít ultracentrifugaci. Dále se používají semikvantitativní a kvantitativní imunometody s reprodukovatelností 3,4 – 11,0 %.

Hemaglutinační inhibice používá erytrocyty citlivé vůči myoglobinu (myoglobin je chemicky vázán na membránu erytrocytu). Při smíchání s protilátkou vůči myoglobinu dochází k aglutinaci, ale přidá-li se současně vzorek obsahující myoglobin je v kompetici o vazebná místa protilátky hemaglutinace inhibována. Semikvantitativní metoda je málo citlivá a obtížně se zajišťuje reprodukovatelnost analýzy, proto se používá omezeně. Mez detekce 50 µg/l.

Latexová aglutinace je rychlý semikvantitativní test zvýšené koncentrace myoglobinu v séru. Latexové kuličky potažené protilátkou vůči myoglobinu aglutinují, což lze odečítat vizuálně. Metoda je snadno proveditelná, ale málo citlivá. Při postupu interferuje revmatoidní faktor, pokud není vyvázán na absorpční médium. Mez detekce je 80 µg/l.

Fixace mikrokomplementu se používá pro kvantitativní detekci myoglobinu v séru nebo moči. Sleduje se spotřeba ovčích erytrocytů zcitlivěných hemolysinem při soutěži s imunokomplexem hemoglobin-antihemoglobin o komplement. Rozsah hemolýzy erytrocytů je nepřímo úměrný koncentraci myoglobinu. Metoda se používá omezeně, protože není dost citlivá (300 µg/l), pracná a obtížně se zajišťuje její reprodukovatelnost.

Nefelometrie je běžně používaná, rychlá a přesná metoda, kdy se detekuje rozptýlené světlo na precipitátu myoglobinu a odpovídající protilátky. Mez stanovitelnosti 26 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii je CV 2,8 – 4,7 %, celková reprodukovatelnost 5,0 – 10,6 %.

Turbidimetrie sleduje nárůst absorbance při vzniku precipitátu na běžném analyzátoru. Ke změně absorbance je třeba větší množství precipitátu, takže metoda je asi o řád méně citlivá proti nefelometrii. Reprodukovatelnost v sérii je CV 0,6 – 2,4 %, celková reprodukovatelnost 2,0 – 5,8 %.

Při kompetitivní RIA soutěží konjugát ¹²⁵I s myoglobinem a myoglobin ze vzorku o vazebná místa protilátky. Metoda je dostatečně citlivá, ale v současnosti se používá omezeně. Reprodukovatelnost v sérii je CV 3,0 – 3,3 %, mezi dny 8,5 – 9,4 %.

Často používaná je sendvičová ELISA. Mikrotitrační jamka je potažena kotvící protilátkou vůči myoglobinu a po navázání myoglobinu se na jeho další vazebné místo dostává druhá protilátka značená enzymem. Mez detekce je 5 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 3,9 – 6,6 %, mezi sériemi 5,2 – 11,8 %; výtěžnost 89,3 – 118,8 %.

Myoglobin se také stanovuje jako POCT, kdy se využívá samokalibrační systém. Z krve je separována plazma, která reaguje s fluoroforem značenou protilátkou. Imunokomplex se pak zachytí při chromatografii v měřící zóně na druhou protilátku. Intenzita fluorescence odpovídá koncentraci myoglobinu.

Kvantitativní měření fluorescence využívá 4-metylumbeliferon, který vzniká po defosforylaci fluorogenu pomocí ALP, která je navázaná na druhou protilátku vzniklého sendvičového imunokomplexu. Reprodukovatelnost v sérii je CV 1,7 – 5,2 %, celková reprodukovatelnost 3,1 – 9,5 %.

Chemiluminiscence využívá princip, kdy se na paramagnetické částice potažené kozí polyklonální protilátkou proti biotinu naváže přes biotin monoklonální protilátka vůči myoglobinu. Na ní se váže stanovovaný myoglobin a na jeho druhé vazebné místo druhá protilátka proti biotinu značená ALP. Po separaci se sleduje luminiscence organického peroxidu adamantyldioxetanu z něhož byl ALP odštěpen fosfát. Reprodukovatelnost v sérii je CV 2,1 – 5,3 %, celková reprodukovatelnost 4 – 11 %.

Protisměrná imunoelektroforéza spojuje precipitaci na agarózovém gelu s elektroforézou a umožňuje detekci v séru i v moči. Myoglobin putuje k anodě a protilátka ke katodě. Tato kvalitativní metoda se používá omezeně, protože je málo citlivá – 2 mg/l.

Izoelektrická fokuzace používá nelineární pH gradient 3 – 10. Dosažitelná je reprodukovatelnost CV < 10 %.

Myoglobin lze také stanovit dvojrozměrnou kapalinou chromatografií. Aniontovou výměnnou chromatografií se odstraní většina bílkovin, pak se myoglobinová frakce rozštěpí trypsinem a nastříkne na kapilární HPLC kolonu. Po ionizaci elektrosprejem následuje detekce MS detektorem s iontovou pastí. Reprodukovatelnost metody je CV 7,0 – 13,4 %, vychýlení -6,9 až +10,1 %. Průměrné vychýlení od správné hodnoty je +2,46 %. Tato metoda je navržena jako referenční metoda s použitím koňského myoglobinu jako vnitřního standardu. Analýzu lze provádět také standardní HPLC se spektrální detekcí detektorem s diodovým polem.

Primární referenční materiál dosud není k dispozici, ale za nejlepší sekundární referenční materiál (rok 2004) je považované lidské lyofilizované sérum s navážkou myoglobinu od firmy HyTest. Při jeho zavedení lze snížit rozdíly mezi výsledky jednotlivých metod na 13 %.

Tolerační rozmezí EKK je 30 %.

Interference

Výsledky stanovení myoglobinu v séru snižují: EDTA, stres, aj.

Výsledky stanovení myoglobinu zvyšují: chylomikra, intramuskulární injekce, lipémie, otrava mědí, cvičení, úrazy, aj.

Výsledky stanovení myoglobinu v moči jsou nižší v alkalické moči nebo působením kyseliny askorbové.

Výsledky stanovení myoglobinu v moči zvyšují: elektrošoky, etanol, horečka, hypotermie, chlornan, lékořice, malárie, mikrobiální peroxidáza, cvičení, aj.

Další informace

Principy analytických postupů

Petr Štern, 2011-02-28