Stanovení metotrexátu

Synonyma

methotrexate, MTX,

(2S)-2-[[4-[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl-methylamino]benzoyl]amino]pentandiová kyselina,

N-[(4-{[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl](methyl)amino}fenyl)karbonyl]-L-glutamová kyselina

Amethopterin, Folex, Hdmtx, Methylaminopterin, Mexate, Rheumatrex, Trexall

Preanalytická fáze

Stanovení se provádí v séru popřípadě v plazmě (antikoagulant heparin) nebo likvoru. Velmi nízká hladina je prokazatelná spíše v kapilární než ve venózní plazmě.

Stabilita vzorku 20 – 25 °C (plazma, sérum): 4 h – 2 dny, 2 – 8 °C (plazma, sérum): 3 dny, -20 °C (plazma, sérum): 1 – 6 měsíců. Zabránit přístupu světla, adsorpce na separační gely (možnost falešně negativních výsledků).

Biologický poločas 10,4 h.

Poznámky k analytické metodě

Metotrexát se měří v séru klasickými analytickými metodami s využitím fotometrické nebo fluorimetrické detekce, imunochemickými postupy a HPLC. Imunochemické postupy jsou nejběžnější a mohou být plně automatizované. Používá se radioimunoanalýza, enzymová imunoanalýza (ELISA i EMIT) a fluorescenční homogenní polarizační technika (FPIA) a chemiluminiscenční analýza. HPLC se používá spíše jako srovnávací a forenzní metoda, než pro rutinní praxi.

Spektrofotometrická metoda je založena na vazbě metotrexátu na enzym dihydrofolát reduktázu (DHFR), což vede k inhibici katalytické aktivity DHFR. Afinita metotrexátu k DHFR je mnohem větší, než k přirozenému substrátu – kyselině dihydrolistové. Měří se zbytková aktivita DHFR po přidání dihydrofolátu a NADPH. Sleduje se inhibice enzymu při redukci dihydrofolátu pomocí NADPH na tetrahydrofolát za vzniku NADP⁺ při 340 nm. Pokles aktivity DHFR způsobený metotrexátem je přímo úměrný jeho koncentraci ve vzorku. Metoda může být rutinně používaná a je snadno automatizovatelná. Mez detekce je 20 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV je 4,74 – 6,12 %, mezi dny 5,9 – 7,9 % výtěžnost 96,5 – 103 %. Při analýze interferují metotrexát diglutamát a metotrexát triglutamát 100 %, kyselina 2,4-diamino-N¹⁰-metylpterinová (DAMPA) 10 %, 7-hydroxymetotrexát 1 %. Neruší bilirubin do 171 µmol/l a hemoglobin do 1 g/l. Pro dosažení správných výsledků je důležité vybrat vhodný zdroj enzymu DHFR. Bakterie, jako Lactobacillus casei vážou léčivo trimethoprim a to způsobuje falešnou pozitivitu výsledků. K tomu nedochází, jestliže se DHFR získává z hovězích jater.

Před fluorimetrickou detekcí je nutné provést vysrážení bílkovin trichloroctovou kyselinou a extrakci do n-butanolu. Po další extrakci do vodné fáze je metotrexát oxidován manganistanem draselným na 2,4-diaminopteridin-6-karboxylovou kyselinu. Fluorescenční detekce používá excitační vlnovou délku 370 nm a emisní vlnovou délku 450 nm. Metoda se běžně nepoužívá, protože je nespecifická, zdlouhavá a obtížně automatizovatelná. Metoda je lineární v rozsahu 0,17 – 2,31 µmol/l. Vychýlení bylo ±15 %, reprodukovatelnost v sérii CV < 10 % a výtěžnost 99,8 %.

Radioimunoanalýza využívá vždy kompetitivní reakce mezi vzorkem značeným ³H nebo ¹²⁵I o vazebná místa na DHFR nebo na protilátce vůči metotrexátu.

Postup kompetitivní reakce mezi vzorkem značeným ³H nebo ¹²⁵I o vazebná místa na DHFR má mez detekce 10 nmol/l. Nenavázané léčivo se oddělí absorpcí na dřevěném uhlí a po centrifugaci uhelných granulí se supernatant obsahující radioaktivně značené DHFR měří beta- nebo gama-počítačem. Radioaktivita supernatantu je nepřímo přímo úměrná koncentraci metotrexátu ve vzorku. Komerční souprava má mez detekce 10 nmol/l. DHFR se získává z hovězích jater. Křížová reaktivita 7-hydroxymetotrexátu je 4 % a DAMPA 20 %.

Postup kompetitivní reakce mezi vzorkem značeným ³H nebo ¹²⁵I o vazebná místa na protilátce vůči metotrexátu má mez detekce 5 nmol/l a nevykazuje výše uvedené interference. Imunokomplex se po kompetitivní reakci nechá reagovat s druhou protilátkou a vznikne precipitát, který separuje.

Byla popsána také kontinuální průtoková radioimunoanalýza, kdy je protilátka proti metotrexátu kovalentně vázaná na částice oxidu železitého potažené celulózou. Imunokomplex a volná frakce se po kompetitivní reakci mezi značeným a neznačeným metotrexátem oddělí pomocí vnějšího magnetického pole. Radioaktivita feromagnetických částic bude nepřímo úměrná koncentraci metotrexátu ve vzorku.

Kompetitivní ELISA vychází ze soutěže metotrexátu ze vzorku a metotrexátu značeného β-galaktosidázou o protilátku. Imunokomplex se separuje pomocí druhé protilátky a aktivita enzymu se sleduje fotometricky po reakci s o-nitrofenyl-β-d-galaktopyranosidem jako vznik o-nitrofenolu při 420 nm. Byla zjištěna křížová reaktivita DAMPA 40 %. Mez detekce je v nmol/l.

Kompetitivní ELISA může také probíhat mezi metotrexátem vázaným na polystyrénových kuličkách a metotrexátem ze vzorku o vazebná místa na protilátce označené peroxidázou. Množství peroxidázy vázané na polystyrénových kuličkách se zjišťuje po separaci imunokomplexu měřením oxidačního produktu o-fenylendiaminu při 492 nm a je přímo úměrné koncentraci metotrexátu ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,7 %, mezi sériemi 3,2 %.

EMIT používá jako značku glukóza-6-fosfátdehydrogenázu a kompetitivní uspořádání imunochemické reakce. Aktivita nevázaného konjugátu je měřena jako vznikající NADH při 340 nm oxidací glukóza-6-fosfátu na 6-fosfoglukonát. Běžně používaný automatizovatelný postup má citlivost 200 nmol/l. Byla zjištěna křížová reaktivita DAMPA 100 % a 7-hydroxymetotrexátu 30 %. Dále negativní interference hemoglobinu při koncentraci > 1 g/l. Detekční limit byl 3 nmol/1. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 1,2 – 7,4 % a mezi sériemi 3,2 – 13,5 %; výtěžnost byla 85 – 115 %.

Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze (FPIA) v kompetitivním uspořádání. Běžně používaný automatizovatelný postup má citlivost 50 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii je CV 1,1 – 3,3 %, mezi sériemi 4,5 – 7,1 %. Byla zjištěna křížová reaktivita DAMPA 44 % a 7-hydroxymetotrexátu 0,6 %.

Kompetitivní bioluminiscence vychází ze soutěže metotrexátu ze vzorku a metotrexátu značeného enzymem o protilátku a měří se enzymová aktivita imunokomplexu jako bioluminiscence. Pokud se jako marker používá luciferáza není použití metody běžné i když je citlivost v nmol/l. Imunokomplex se separuje pomocí druhé protilátky a aktivita luciferázy se detekuje pomocí ATP a luciferinu.

HPLC začíná vysrážením bílkovin (precipitaci se lze vyhnout při použití předkolony) a nástřikem supernatantu na reverzní fázi kolony C18, kde se rozdělí metotrexát, 7-hydroxymetotrexát a DAMPA. HPLC se považuje neoficiálně za referenční metodu. Citlivost metody je 50 nmol/l a metotrexát se detekuje UV detektorem při 308 nm. Reprodukovatelnost v sérii CV 3,0 – 9,9 %, mezi sériemi 6,1 – 10,5 %.

Jiný postup HPLC oxiduje metotrexát manganistanem draselným na 2,4-diaminopteridin-6-karboxylovou kyselinu, která se detekuje fluorimetrickým detektorem (excitace 275 nm, emise 410 nm).

Další HPLC postup redukuje metotrexát dithioničitanem sodným na 2,4-diamino-6-metylpteridin, který se detekuje fluorimetrickým detektorem (excitace 367 nm, emise 463 nm).

Toleranční rozpětí v EKK je 30 %.

Interference

Výsledky stanovení metotrexátu snižují: separační gely.

Výsledky stanovení metotrexátu zvyšují: 7-hydroxymetotrexát, kyselina 2,4-diamino-N¹⁰-metylpterinová, metotrexát diglutamát, metotrexát triglutamát, trimethoprim, aj.

Další informace

Principy analytických postupů

Petr Štern, 2011-02-28